A novel 75 cm column size gives increased resolution and better sequence coverage

Význam tématu

V bottom-up proteomice je klíčové efektivní oddělení směsí peptidů a maximální rozlišení jednotlivých špiček, což zásadně ovlivňuje míru identifikace a pokrytí sekvencí proteinů. Vývoj kapilárních UHPLC kolonek s delší účinnou délkou umožňuje zvýšit kapacitu špiček, zlepšit citlivost a tím i hloubku proteomického rozboru.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat, že nový 75 cm Acclaim PepMap C18 column s integrovanou nanoelektrosprávou zlepší chromatografické rozlišení oproti konvenční 50 cm verzi. Pomocí prodlouženého gradientu a standardní HeLa digest vzorku s PRTC peptide mixem autoři porovnali identifikační výkonnost, kapacitu špiček a pokrytí sekvence.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific EASY-nLC 1200 splitless nanoUHPLC systém s nanoViper spojkami
• EASY-Spray zdroj s integrovanou C18 kolonkou a emitorem (75 cm ES805A a 50 cm ES803A)
• Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostní spektrometr
• Spotřební materiály: vodní a acetonitrilová fáze UHPLC/MS kvality, formiát a standardní Peptide Retention Time Calibration Mixture (PRTC), HeLa Protein Digest Standard

Použitá metodika

Pro experiment byl připraven vzorek obsahující 1 μg HeLa digestu s 100 fmol PRTC peptidů v poměru 98:2 voda/acetonitril s 0,08 % kyseliny mravenčí. 1 μl bylo injikováno při průtoku 200 nl/min. Gradient zahrnoval postupné zvýšení organické fáze B až na 95 % v průběhu 490 min. Kolonka byla temperována na 35 °C. MS provoz probíhal v režimu data-dependent acquisition s rozlišením 60 000 pro MS a 15 000 pro MS/MS, použit byl algoritmus SEQUEST HT v Proteome Discoverer 2.1.

Hlavní výsledky a diskuse

• 75 cm kolonka vykázala o 43 % více peptide spectral matches (170 574 vs 118 050 PSM), o 26 % více identifikovaných peptidových skupin a o 5 % více proteinových skupin oproti 50 cm verzi
• Výpočet kapacity špiček (peak capacity) při 500 min gradientu vzrostl ze 800 (50 cm) na 1050 (75 cm), nárůst o 31 %
• Šířka špiček v polovině výšky (PWHH) pro tři PRTC peptidy se snížila z 33–38 s na 24–28 s bez významného prodloužení retenčních časů
• Provozní tlak u 75 cm kolony dosahoval 600–700 bar oproti 450–500 bar u 50 cm, přičemž oba rozsahy jsou plně podporovány EASY-nLC 1200
• RSD retenčních časů dosahovalo přibližně 0,4 %, což odpovídá posunu menšímu než 1,5 minuty v průběhu gradientu

Přínosy a praktické využití metody

Délka 75 cm kolony přináší výrazné zvýšení rozlišení a citlivosti, což umožňuje hloubkovou a spolehlivější analýzu komplexních proteomických vzorků. Zvýšená kapacita a nižší šířka špiček zlepšují kvantitativní i kvalitativní výsledky v QA/QC, biomarkerovém výzkumu a systematické proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další prodlužování kolonek a optimalizace gradientních protokolů pro vyšší kapacitu špiček
• Integrace ultravysoce tlakově odolných systémů a automatizovaných workflow pro lepší reprodukovatelnost
• Vývoj nových fázových materiálů a hybridních povrchových úprav pro větší selektivitu
• Adaptace pro mikroproudovou a multimodální chromatografii ke zvýšení robustnosti a pokrytí proteomu

Závěr

Použití 75 cm EASY-Spray Acclaim PepMap C18 kolony pro nanoLC-MS/MS vede k významnému zlepšení kapacity špiček, pokrytí sekvencí a citlivosti oproti tradiční 50 cm verzi. Metoda poskytuje robustní a reprodukovatelné řešení pro náročné proteomické analýzy.

Reference

• Wilhelm M et al Mass-spectrometry-based draft of the human proteome Nature 2014 509(7502):582–587
• Wu X et al Global phosphotyrosine survey in triple-negative breast cancer reveals activation of multiple tyrosine kinase signaling pathways Oncotarget 2015 6(30):29143–29160
• Cox J Mann M Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology Annu Rev Biochem 2011 80:273–299
• Lopez-Ferrer et al Pushing the limits of bottom-up proteomics with state-of-the-art capillary UHPLC and Orbitrap mass spectrometry for reproducible quantitation of proteomes Thermo Fisher Scientific Application Note AN639 2016