LC-MS: Vanquish Neo UHPLC system sets new performance standards for single-shot nanoLCMS bottom-up proteomics

Význam tématu

Růst zájmu o hlubokou analýzu proteomu pohánějí výzvy v oblasti biomedicíny, zejména při objevování biomarkerů a personalizované medicíně. Vysoká složitost a dynamický rozsah proteinů v biologických vzorcích (např. lidská plasma nebo buněčné extrakty) vyžaduje analytické platformy s maximální citlivostí, rozlišením a reprodukovatelností. NanoLC–MS systémy jsou v tomto kontextu klíčové, protože delší kolony a nízké průtoky zvyšují chromatografickou kapacitu, zlepšují ionizaci a umožňují detekci stopových složek.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je ukázat, jak nová generace nízkoproudého UHPLC Vanquish Neo ve spojení s vysokorozlišovacím Orbitrap Exploris 480 posouvá hranice jednokrokových nanoLCMS bottom-up proteomických analýz. Studie demonstruje:

• Rychlé nahrávání vzorku a ekvilibraci dlouhých nano-kolon (75 µm × 50 cm a 75 µm × 75 cm).
• Zvýšení chromatografické kapacity a snížení šířky špiček (FWHM).
• Možnost provozu při různých průtocích (200–500 nL/min) pro optimalizaci ESI citlivosti.
• Spojení dvou nano-kolon do celkové délky 150 cm pro maximální rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Thermo Scientific Pierce HeLa Digest/PRTC standard (400 ng/µL HeLa + 200 fmol/µL PRTC).
UHPLC systém: Vanquish Neo (1500 bar), konfigurace v Chromeleon CDS přes SII pro Xcalibur.
Kolony:

• Thermo Scientific EASY-Spray PepMap Neo 2 µm, 75 µm × 500 mm a 75 µm × 750 mm.
• DNV PepMap Neo dvojitá nanoViper kolona 75 µm × 750 mm.

MS detekce: Orbitrap Exploris 480 v režimu data-dependent acquisition (DDA), rozlišení 60 000 (MS1), 15 000 (MS2), FDR <1 %.
Chromatografie: gradienty 90–240 min, průtok 0,25 µL/min, teploty sloupce 50–60 °C, autosampler 7 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Rychlost nahrávání a ekvilibrace:

• UHPLC pracuje při 1500 bar, což zkracuje dobu nahrávání a ekvilibrace dlouhých kolon až o 50 %.

2. Chromatografická kapacita:

• Přechod z 50 cm na 75 cm vede ke zkrácení FWHM o 2–4 s (90min gradient).

3. Hluboké pokrytí proteomu:

• 240min gradient na 75 cm kolóně identifikoval ~80 000 peptidů a >7 100 proteinů při 400 ng vzorku.

4. Reprodukovatelnost:

• Mezi čtyřmi 75 cm kolónami je rozdíl v počtu proteinů <1 %, peptidů <5 %.

5. Flexibilita průtoku:

• Zvýšení průtoku z 200 na 500 nL/min zlepšilo MS1 citlivost až o 40 %, aniž by se změnil počet MS2 událostí nebo identifikovaných peptidů.

6. Column coupling:

• Spojením dvou 75 cm nano-kolon do 150 cm se dosáhlo dalšího zúžení šířky špiček (~3 s) a tlaku až 1350 bar během separace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší obsluha a vyšší průchodnost dat (MSU >80 %).
• Možnost hluboké profiling proteomu pro výzkum i QA/QC aplikace.
• Vysoká reprodukovatelnost mezi kolónami i běhy.
• Flexibilní úprava průtoku pro optimalizaci citlivosti nebo rychlosti měření.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší adaptace ultra-dlouhých nano-kolon (>150 cm) pro mimořádné rozlišení.
• Automatizované on-line úpravy průtoku a gradientu podle kvality vzorku.
• Integrace s real-time datovou analýzou a umělou inteligencí pro okamžitou kvalifikaci vzorků.
• Rozšíření aplikací do imgenerace PTM profilů a single-cell proteomiky.

Závěr

Vanquish Neo UHPLC ve spojení s Orbitrap Exploris 480 a novými PepMap Neo kolónami přináší výrazné zvýšení chromatografického rozlišení, citlivosti a provozní efektivity nanoLCMS bottom-up proteomiky. Systém podporuje dlouhé gradienty, vysoký tlak až 1500 bar a flexibilní průtokové režimy, což umožňuje dosažení hlubokého a reprodukovatelného proteomického profilu v rámci jediného měření.

Reference

1. Schwenk J.M. et al. The Human Plasma Proteome draft of 2017: building on the Human Plasma Peptide Atlas from mass spectrometry and complementary assays. J. Proteome Res. 2017, 16, 4299–4310.
2. Cox J., Mann M. Quantitative, high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu. Rev. Biochem. 2011, 80, 273–299.
3. Köcher T. et al. Development and performance evaluation of an ultralow flow nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry set-up. Proteomics 2014, 14(17–18), 1999–2007.
4. Wang X. et al. Peak capacity optimization of peptide separations in reversed-phase gradient elution chromatography. Anal. Chem. 2009, 78(10), 3406–3416.
5. Lopez-Ferrer D. et al. Pushing the limits of bottom-up proteomics with state-of-the-art capillary UHPLC and Orbitrap mass spectrometry for reproducible quantitation of proteomes. Thermo Fisher Sci. Appl. Note AN639, 2016.
6. Wilm M., Mann M. Analytical properties of the nano electrospray ionization source. Anal. Chem. 1996, 68(1), 1–8.
7. Köcher T. et al. Ultra-High-Pressure RPLC Hyphenated to an LTQ-Orbitrap Velos Reveals a Linear Relation between Peak Capacity and Number of Identified Peptides. Anal. Chem. 2011, 83(7), 2699–2704.
8. Ferguson J. et al. A novel 75 cm column size gives increased resolution and better sequence coverage. Thermo Fisher Sci. Appl. Note AN21550, 2019.