Simultaneous quantitation of nine nitrosamines using a highly sensitive and LC-HRAM mass spectrometry method in multiple drug products

Význam tématu

V posledních letech byly v řadě farmaceutických produktů odhalené nitrosaminy s genotoxickým potenciálem, zejména v antihypertenzivech ze skupiny sartanů a v antidiabetiku metforminu. Regulační úřady (FDA, EMA) stanovily přísné limity pro tyto látky, a proto je vysoce žádoucí mít spolehlivou, citlivou a univerzální metodu pro jejich simultánní detekci a kvantifikaci přímo v hotových lécích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit a popsat výkonnost LC-HRAM Orbitrap metody (Q Exactive Plus) pro simultánní stanovení devíti N-nitrosaminů dle doporučeného protokolu FDA, s drobnými úpravami pro zlepšení citlivosti a tvaru píků. Analýza byla aplikována na API i tablety losartanu, valsartanu, irbesartanu, azilsartanu, olmesartanu a metforminu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika pracuje s následujícími kroky:

• Příprava standardních směsí: rozpuštění čistých standardů (10 mg v 10 mL metanolu), následné ředění do 0,1–20 ng/mL.
• Extrakce vzorků: rozemletí tablet, třepání 45 min v 100% metanolu, centrifugace, filtrace 0,22 µm.
• Chromatografie: gradientní eluce na biphenylovém sloupci (150 × 3,0 mm, částice 2,6 µm) s trojím rozpouštědlem (A: voda s 0,1% kys. mravenčí, B: metanol–acetonitril 80:20, C: acetonitril s 0,1% kys. mravenčí); průtok 0,4 mL/min, teplota 40 °C, doba běhu 28 min.
• HRAM detekce: paralelní režimy PRM a t-SIM s rozlišením 35 000 až 70 000 a AGC cíli až 1e6, polární přepínání pro rozlišení koelujících analytů (NMBA vs. NMEA).

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Linearity: rozsah 0,5–20 ng/mL (0,005–0,2 ppm) s R2 > 0,997 pro všechny látky.
• Citlivost: LOD 0,1–0,5 ng/mL, LOQ 0,5–2,0 ng/mL dle nitrosaminu, S/N > 30.
• Reprodukovatelnost: %RSD při LOQ < 7 % a při standardní úrovni (< 6 %).
• Recovery: v maticích valsartanu i metforminu 80–120 % při nízkých (1 ng/mL), středních (3 ng/mL) i vysokých (20 ng/mL) koncentracích.
• Selektivita: vysoké rozlišení (≥120 000) efektivně oddělilo izobarické interference (¹²C vs. ¹⁵N), např. NDMA vs. DMF.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje farmaceutickým laboratořím:

• Rychlé a simultánní stanovení devíti klíčových nitrosaminů v jedné analýze bez nutnosti separátního měření.
• Dosáhnout ultranízkých detekčních limitů s min. vkladem 3 μL.
• Zaručit shodu s regulačními požadavky FDA a EMA pro kontrolu genotoxických nečistot v lécích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování metodiky:

• Adaptace na nové genotoxické látky a další lékové třídy.
• Využití plně automatizovaných přípravných linek a online vzorkování pro zvýšení throughputu.
• Implementace umělé inteligence pro automatizovanou kontrolu kvality píků a prediktivní údržbu systému.
• Prohloubení studia mechanismů vzniku nitrosaminů přímo v procesních výrobních krocích.

Závěr

Vyvinutá LC-HRAM Orbitrap metoda poskytuje robustní, vysoce citlivé a selektivní stanovení devíti nitrosaminů v sartanových i metforminových přípravcích. Splňuje nebo překračuje požadavky regulačních úřadů a je připravena pro rutinní farmaceutickou kontrolu.

Reference

1. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs – Guidance for Industry, U.S. FDA, 2020.
2. Rostkowska K. et al., Formation and metabolism of N-Nitrosamines. Pol. J. Environ. Stud. 1998;7:321–325.
3. LC-ESI-HRMS Method for Nitrosamines in Metformin, U.S. FDA, 2021.
4. LC-HRMS Method for NDMA in Metformin, U.S. FDA, 2021.
5. LC-HRMS Method for Six Nitrosamines in ARB Drugs, U.S. FDA, 2020.
6. Thermo Scientific Application Note 21922: GC-MS Determination of Genotoxic Nitrosamines in Valsartan.
7. HRAM LC-MS Method for Nitrosamine Impurities in Drugs, Thermo Scientific.