A quick and robust mass spectrometry-based method for the detection of SARS-CoV-2

Význam tématu

Masová spektrometrie založená na bottom-up proteolytickém přístupu představuje perspektivní doplňkovou metodu k RT-PCR pro detekci aktivní infekce SARS-CoV-2 prostřednictvím kvantifikace virových proteinů. Metoda rozšiřuje kapacitu testování, nabízí informaci o virové náloži a umožňuje sledovat mutace, které mohou ovlivnit cíl PCR či antigenové testy.

Cíle a přehled studie

Vyvinout rychlý (4 minuty), robustní a spolehlivý protokol pro absolutní kvantifikaci šesti peptidů z virových proteinů (spike a nukleokapsid) v nosní tekutině a slinách uložených ve virovém transportním médiu. Metoda využívá enzymatickou digesci, reverzní fázovou UHPLC separaci a cílenou SRM analýzu.

Použitá metodika

Úvodní kroky zahrnovaly přidání rekombinantního spike a nukleokapsidového proteinu do vzorků nosní tekutiny na tamponu nebo slin, precipitaci acetónem, resuspensi v SMART Digest pufru a trypticko-chymotrypsinovou digesci při 70 °C. Po 10× ředění v roztoku s 0,2 % kyseliny mravenčí následovala injekce 10 µl do Vanquish MD UHPLC s lineárním gradientem (0,5 ml/min, 0–70 % ACN+IPA) a rychlá selektivní SRM měření na TSQ Altis MD (pozitivní iontový režim, Q1/Q3 rozlišení 1,2 FWHM). Kalibrace proběhla ve 3 replikátech se stabilně označenými standardy pro interní korekci.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific TSQ Altis MD masový spektrometr
• Thermo Scientific Vanquish MD UHPLC systém
• Thermo Scientific Hypersil GOLD C18 kolona (2,1×50 mm, 1,9 µm)
• SMART Digest Trypsin Kit (70 °C, 90 min)
• TraceFinder LDT 1.0 software pro data processing

Hlavní výsledky a diskuse

Tři z pěti nukleokapsidových peptidů a jeden ze spike proteinu vykázaly limity detekce 0,25–5 fmol na koloně a limity kvantifikace 0,5–10 fmol. Linearity dosáhly R2>0,99 při váhování 1/x nebo konstantním. Retenční časy byly vysoce reprodukovatelné (±0,01 min). Metoda prokázala vysokou selektivitu díky vhodnému výběru SRM přechodů, interním standardům a rychlé chromatografii do 4 min.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• rychlý turnaround (<4 min na vzorek),
• absolutní kvantifikaci virové nálože,
• nízké riziko falešně negativních/pozitivních výsledků díky více cíleným peptidům,
• možnost rozšíření panelu o další patogeny či varianty.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření multiplexního panelu na další respirační patogeny (influenza, RSV, M. tuberculosis), implementace variant-specifických peptidů, plná automatizace přípravy a zpracování dat, integrace do klinických LDT/IVD prostředí pro rychlé nasazení v dalších epidemiích.

Závěr

Vyvinutá 4minutová UHPLC-SRM metoda na TSQ Altis MD masovém spektrometru poskytuje robustní, cílenou a kvantitativní analýzu virových peptidů SARS-CoV-2 srovnatelnou s PCR, ale obohacenou o informaci o virové náloži a vyšší flexibilitu pro detekci variant či multiplexních panelů.

Reference

1. Cardozo K, et al. Establishing a Mass Spectrometry-based System for Rapid Detection of SARS-CoV-2 in Large Clinical Sample Cohorts. Nat Commun. 2020;11:6201.
2. The New York Times. Coronavirus in the US: Latest Map and Case Count. 2020.
3. Johansson MA, et al. SARS-CoV-2 Transmission from People without COVID-19 Symptoms. JAMA Netw Open. 2021;4(1):e2035057.
4. He J, et al. Diagnostic Performance Between CT and Initial Real-Time RT-PCR for Clinically Suspected COVID-19 Patients Outside Wuhan, China. Respir Med. 2020;168:105980.
5. CDC. SARS-CoV-2 Variant Classifications and Definitions. 2021.
6. CDC Science Brief: Emerging SARS-CoV-2 Variants. 2021.
7. Mahmud I, Garrett TJ. Mass Spectrometry Techniques in Emerging Pathogens Studies: COVID-19 Perspectives. J Am Soc Mass Spectrom. 2020;31(10):2012–2024.
8. Bankar R, et al. Proteomic Investigation Reveals Dominant Alterations of Neutrophil Degranulation and mRNA Translation Pathways in Patients with COVID-19. Cell Press. 2021;24(3):102135.
9. ECDC. Detection of New SARS-CoV-2 Variants Related to Mink. 2020.
10. Korber B, et al. Tracking Changes in SARS-CoV-2 Spike: Evidence That D614G Increases Infectivity of the COVID-19 Virus. Cell Press. 2020;182(4):812–827.
11. Fiorentini S, et al. First Detection of SARS-CoV-2 Spike Protein N501 Mutation in Italy in August, 2020. Lancet Infect Dis. 2021;21(6):147.
12. Zhu J, et al. Viral Dynamics of SARS-CoV-2 in Saliva from Infected Patients. J Infect. 2020;81(3):48–50.
13. Iwasaki S, et al. Comparison of SARS-CoV-2 Detection in Nasopharyngeal Swab and Saliva. J Infect. 2020;81(2):145–147.
14. LabCorp. Nasopharyngeal Wash Specimen Collection for COVID-19 Testing. 2020.
15. Thermo Fisher Scientific. Smart notes: Coronavirus. 2020.
16. Ihling C, et al. Mass Spectrometric Identification of SARS-CoV-2 Proteins from Gargle Solution Samples of COVID-19 Patients. J Proteome Res. 2020;19(11):4389–4392.
17. CDC. How to Collect a Saliva (Spit) Sample from Your Child. 2020.
18. CDC. Preparation of Viral Transport Medium. 2020.