Targeted assay for quantification of proteins from the SARSCoV- 2 coronavirus

Význam tématu

Vývoj cílených hmotnostně spektrometrických testů pro detekci proteinů SARS-CoV-2 nabízí alternativu k RNA PCR metodám. Měření virových proteinů přímo ve vzorku lidského nosohltanu může doplnit stávající diagnostiku a přinést rychlejší, kvantitativní výsledky s vysokou specifitou.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a optimalizovat MRM (Multiple Reaction Monitoring) test zaměřený na dva hlavní koronavirové proteiny – spike (S) a nukleokapsidový (N). Pomocí rekombinantních proteinů byly stanoveny nejvhodnější peptidové přechody, optimalizovány parametry měření a stanovena detekční citlivost v matrice UTM po přidání do kontrolních výtěrů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita srážka proteinů acetónem, následná denaturace a trávení směsí Trypsin/LysC. Peptidy byly separovány na ExionLC System s kolonou Phenomenex Luna Omega Polar C18 (2,1×100 mm, 3 µm) při rychlém gradientu (0,6 mL/min). Hmotnostní spektrometrie byla prováděna na SCIEX Triple Quad 5500+ System – QTRAP® Ready v pozitivním ionizačním režimu se Scheduled MRM™ algoritmem. Parametry zdroje: ISV 5500 V, GS1 60, GS2 50, TE 600 °C, CUR 30. Optimalizace MRM přechodů a kolizní energie proběhla v programu Skyline, data zpracována v SCIEX OS-Q.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo vybráno 14 analyticky nejvýkonnějších peptidů ze S a N proteinů. Gradient pro jejich separaci efektivně rozdělil všechny cílové signály (obrázek chromatogramů), kalibrační křivky vykázaly lineární závislost s korelačními koeficienty r2 ≥ 0,99. Dolní meze kvantifikace (LLOQ) se pohybovaly v rozsahu 0,28–4,4 fmol/µL UTM, nejlepší citlivost (0,28 fmol/µL) dosahovaly peptidy RSFIEDLLFNK a SFIEDLLFNK ze spike proteinu. Dolní meze detekce (LLOD) spadaly do rozmezí 0,14–4,4 fmol/µL.

Přínosy a praktické využití

Navržená metoda nabízí:

• rychlou a robustní kvantifikaci virových peptidů v typické klinické matrici,
• možnost multiplexního sledování více peptidů pro zvýšení spolehlivosti,
• vysokou citlivost odpovídající požadavkům bioanalytiky,
• lehkou implementaci v laboratořích disponujících QTRAP technologií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je validace na klinických vzorcích pacientů a rozšíření panelu cílených proteinů. Použití stabilně isotopově značených standardů zlepší kvantitativní přesnost. Možné je také přidání dalších virových markerů, automatizace přípravy vzorků a integrace do vysoce průtokových linek pro screening velkého počtu vzorků.

Závěr

Studie demonstrovala, že cílený MRM test na proteiny SARS-CoV-2 lze využít pro citlivou kvantifikaci ve výtěrových vzorcích. I když metoda vyžaduje další klinickou validaci, představuje slibný doplněk k PCR diagnostice a otevře nové cesty v laboratorní virodiagnostice.

Reference

• 1. King J, Kosinski-Collins M, Sundberg E. Coronavirus Structure, Vaccine and Therapy Development.