Including peptide enrichment in a mass spectrometry-based workflow for the absolute quantitation of SARS-CoV-2

Význam tématu

Detekce a absolutní kvantifikace proteinů viru SARS-CoV-2 v klinických vzorcích je klíčová pro spolehlivou diagnostiku a monitorování infekce. Zavedení obohacení peptidů před měřením LC-MS snižuje interferenci matrice, zvyšuje citlivost a umožňuje rychlejší analýzy i při velmi nízkých koncentracích cílového proteinu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat, že zařazení obohacovacího kroku SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) do stávajícího LC-MS workflow zlepší schopnost absolutní kvantifikace nukleokapsidového proteinu SARS-CoV-2 ve vzorcích nosního sekretu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Rekombinantní nukleokapsidový protein SARS-CoV-2 přidaný do nosního sekretu v dopravním médiu.
• Enzymatická digesce trypsinem (SMART Digest Trypsin kit).

Obohacení peptidů:

• Peptidově specifické SISCAPA pro selektivní zachycení cílových peptidů.
• Interní standardy: izotopově značené peptidy odpovídající analyzovaným sekvencím.

Chromatografie a hmotnostní spektrometrie:

• LC systém: Thermo Scientific Vanquish MD HPLC se sloupcem Hypersil GOLD C18 (1.9 µm, 2.1×50 mm).
• MS detekce: Thermo Scientific TSQ Altis MD ve vybraném SRM režimu.

Hlavní výsledky a diskuse

Limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ) pro cílené peptidy spadly do rozsahu nízkých až subfemtomolů na kolonu, s lineární oblastí měření mezi 0,25 a 100 fmol (R2 > 0,99). Koeficienty varibility a relativní standardní odchylky byly pod 15 % v celé analytické oblasti. Obdobné retenční časy peptidů a interních standardů (< ±0,01 min) potvrdily konzistentní chromatografické podmínky. Díky redukované matrice se běh LC scény zkrátil na pouhé 2 minuty při plné separaci pěti klíčových peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení množství nutného spike-in proteinu v klinických vzorcích.
• Zrychlení analýzy díky krátkému 2minutovému LC běhu.
• Možnost rychlého multiplexního měření několika peptidů v úzkém akvizičním okně (30 s).
• Zvýšená robustnost a opakovatelnost díky immuno-obohacení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace do automatizovaných vysokopropustných multikanálových LC-MS systémů pro masový screening.
• Rozšíření panelu cílených virových i buněčných markerů pro komplexní diagnostiku a monitorování infekcí.
• Vývoj snadno přenosných modulárních přístrojů s integrovaným immuno-obohacením pro POC (point-of-care).

Závěr

Zařazení SISCAPA obohacení peptidů do LC-MS workflow pro absolutní kvantifikaci SARS-CoV-2 nukleokapsidového proteinu výrazně zlepšilo citlivost, rychlost i spolehlivost analýzy. Metoda nabízí robustní nástroj pro klinickou diagnostiku a výzkum, umožňuje detekci nízkých koncentrací viru a dobře se integruje do moderních vysokopropustných analytických platforem.

Reference

1. Coronavirus in the US: Latest Map and Case Count. New York Times.
2. He, J. et al. Diagnostic Performance Between CT and Initial Real-Time RT-PCR for Clinically Suspected 2019 Coronavirus Disease (COVID-19). Respir Med. 2020;168:105980.