Rapid Proteome Analysis Using DIA and Super-Resolution Orbitrap Mass Spectrometry

Význam tématu

V moderní proteomice roste potřeba kombinovat vysokou průchodnost analýz s přesnou identifikací a kvantifikací proteinů. Zkrácené gradienty na kapalinové chromatografii umožňují zpracování stovek vzorků denně, ale standardní Fourierova transformace (eFT) omezuje rozlišovací schopnost při zachování rychlého cyklu. Implementace superrezoluce ΦSDM přináší zlepšení hmotnostního rozlišení bez navýšení doby akvizice, což zlepšuje hloubku a spolehlivost proteomu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo:

• Umožnit reálné zpracování celého m/z rozsahu pomocí ΦSDM bez prodloužení doby skenování.
• Otestovat metodu na HeLa a krevní plazmě při krátkých gradientech Evosep One (5–44 minut).
• Vyhodnotit dopad na počet identifikovaných a kvantifikovaných proteinů v DIA režimu.

Použitá metodika a instrumentace

HeLa a plazmatické digesty byly připraveny standardními postupy lýzy, redukce, alkylace a digesce s LysC/trypsinem. Separace probíhala na systému Evosep One spojeném s Orbitrap Exploris 480. Datasety získané v DIA režimu obsahovaly jeden plný sken (MS1) a 39 nebo 53 oken MS2 s transienty 128 ms pro MS1 a 32 ms pro MS2.
Pro reálný výpočet ΦSDM byly použity čtyři grafické karty Titan Xp v pomocném počítači. Extrakce dat a kvantifikace probíhala v software Spectronaut 15 v režimu directDIA nebo s projektově specifickou knihovnou.

Hlavní výsledky a diskuse

• ΦSDM dosahuje dvojnásobné hmotnostní rozlišovací schopnosti při stejném transientu ve srovnání s eFT.
• Při gradientu 5 minut se identifikovalo téměř 3000 proteinových skupin z 100 ng HeLa digestu.
• U directDIA s 21minutovým gradientem bylo identifikováno ~4000 proteinových skupin, u knihovní analýzy až 5600.
• Metoda zvýšila počet identifikovaných proteinů až o 14 % a zlepšila kvantifikaci (CV < 20 %) o 10–19 % napříč testovanými gradienty.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost zpracování až 300 vzorků za den bez kompromisu na hloubce analýzy.
• Spolehlivější kvantifikace díky vyšší masové rozlišitelnosti.
• Rozšíření uplatnění DIA v klinické a průmyslové proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace GPU výpočtů přímo do řídicího počítače analyzátoru.
• Adaptace ΦSDM na jiné typy hmotnostních analyzátorů.
• Uplatnění v analýze post-translačních modifikací a multiplexních experimentů.

Závěr

Superrezoluce ΦSDM v kombinaci s krátkými gradienty Evosep One výrazně zvyšuje hloubku a kvalitu proteomických analýz v režimu DIA bez prodloužení doby měření.

Reference

1. O. Lange et al., Int. J. Mass Spectrom. 377, 338–344 (2015).
2. D. Grinfeld et al., Anal. Chem. 89(2), 1202–1211 (2017).
3. C. D. Kelstrup et al., J. Proteome Res. 17(11), 4008–4016 (2018).
4. N. Bache et al., Mol. Cell Proteomics 17(11), 2284–2296 (2018).
5. V. Ignjatovic et al., J. Proteome Res. 18(12), 4085–4097 (2019).