Characterization of Biotherapeutics with High-Resolution Ion Mobility-Mass Spectrometry

Význam tématu

Charakterizace bioterapeutik je klíčová pro zajištění jejich bezpečnosti a účinnosti. Tradičně se používají oddělené pracovní postupy pro analýzu intaktního proteinu, subjednotek, peptidů a uvolněných glykosidů. Integrace vysokorozlišovací iontové mobility s hmotnostní spektrometrií (HRIM-MS) do jednoho platformového řešení výrazně zvyšuje informační obsah a zefektivňuje celý proces.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo demonstrovat použití LC-HRIM-MS systému spojeného se softwarem Protein Metrics Byos pro komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek (mAb) ve všech čtyřech analytických režimech:

• intaktní protein,
• analýza subjednotek,
• peptidové mapování (oxidace, glykace, deamidace, izomerizace, glykopeptidy),
• uvolněná glykany.

Studie hodnotila schopnost mobility separation, přesnost měření hmotnosti a reprodukovatelnost kvantitativních výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky monoklonální protilátky (Waters Humanized mAb, NIST mAb RM 8671) byly zpracovány pro každý režim podle standardních protokolů. Instrumentace zahrnovala:

• UHPLC Agilent 1290 Infinity II s kolony PLRP-S (intaktní/subjednotky), BEH C18 (peptidové mapování) a Zorbax HILIC Plus (uvolněné glykany),
• HRIM-MS systém MOBIE spojený s Agilent 6545XT,
• softwarové nástroje EyeOn pro akvizici a MassHunter/Protein Metrics Byos s modulem HRIM pro zpracování dat, doplněné IM-MS Browserem pro vizualizaci mobility dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza umožnila selektivní extrakci irelevantních signálů pomocí mobilitní filtrace, což vedlo k hmotnostní přesnosti lepší než 2 ppm a jasnému rozlišení glykoforem. Subjednotky lehkého a těžkého řetězce byly odděleny v mobilitním rozměru, což podpořilo cílenou dekonvoluci signálu. Peptidové mapování prokázalo:

• spolehlivé rozlišení oxidovaných a glykovaných forem s výpočtem procentuálních modifikací,
• identifikaci deamidace a izomerizace pomocí rozdílných příchodových časů,
• separaci izomerů glykopeptidů a jejich kvantitativní hodnocení,
• analýzu C‐terminálního zbytku lysinu a N‐terminální pyroGlutaminu.

Uvolněné glykany byly mobilitně separovány s identifikací izomerů a relativním určením jejich zastoupení s vysokou reprodukovatelností.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma LC-HRIM-MS s modulem Byos přináší:

• jednotné řešení pro všechny charakterizační workflow,
• zvýšenou důvěru v identifikaci posttranslačních modifikací díky mobilitním datům,
• rychlejší a efektivnější zpracování dat bez nutnosti několika instrumentů,
• vysokou reprodukovatelnost kvantifikace (testováno na šestinásobných opakováních).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj HRIM-MS pro kontrolu jakosti v biotechnologickém průmyslu, rozšíření na další třídy biologik (např. proteiny s konjugovanými léčivy) a potenciál pro automatizovanou analýzu poháněnou strojovým učením. Zvýšené rozlišení mobility a integrace s cloudovými platformami otevřou cestu k real-time monitoringu výrobních procesů.

Závěr

Použití LC-HRIM-MS v kombinaci s Protein Metrics Byos představuje efektivní a informačně bohatou platformu pro komplexní charakterizaci bioterapeutik. Tento přístup zvyšuje přesnost měření, zkracuje dobu analýzy a konsoliduje tradičně oddělené pracovní postupy do jednoho systému.

Reference

Broome S.A., Wormwood Moser K.L., Carroll F. Characterization of Biotherapeutics with High-Resolution Ion Mobility-Mass Spectrometry. MOBILion Systems Inc. whitepaper.