Agilent Nanospray and HPLC-Chip/MS Protein Identification Solutions - Quick Start Guide

Význam tématu

Proteinová identifikace pomocí nanoLC-MS/MS je klíčová pro výzkum v proteomice a biomedicínské analytice. Metody založené na nanospray nebo HPLC-Chip® platformě umožňují citlivé a reprodukovatelné stanovení proteinů z komplexních biologických vzorků s minimálními objemy a vysokou separační účinnost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této příručky je představit kompletní řešení Agilent Protein ID Solutions pro nanospray LC-MS/MS: od přípravy vzorků, jejich frakcionace a tryptického štěpení až po čištění peptidů, chromatografickou analýzu a identifikaci pomocí softwarů Spectrum Mill a Mascot. Důraz je kladen na srovnání klasického nanoflow HPLC systému a mikrofluidického HPLC-Chip® řešení.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestává z následujících kroků:

• Odebrání vysoce zastoupených proteinů: MARS kolony nebo spin cartrige (human/mouse/rat)
• Koncentrace nízkomolekulárních proteinů pomocí ultrafiltračních koncentračních tub
• Frakcionace: 1D či 2D gelová elektroforéza nebo SCX frakcionace
• Redukce a alkylace disulfidických vazeb a tryptické štěpení in-gel nebo in-solution
• Čištění peptidů na C18 pipetových tiplách nebo spin tubách
• Chromatografie: 1D on-line LC nebo offline 2D SCX/RP, buď s konvenčním nanoflow HPLC nebo s HPLC-Chip®
• MS/MS analýza: Agilent ion trap LC/MSD Trap XCT Ultra nebo nanoESI s mikrofluidickým čipem
• Datová analýza: Spectrum Mill MS Proteomics Workbench nebo Mascot (s automatizovaným exportem *.mgf)

Klíčová zařízení:

• Agilent 1100/1200 series nanoflow HPLC nebo HPLC-Chip®/MS Interface
• Agilent Ion Trap MS (LC/MSD Trap XCT Ultra)
• Spectrum Mill software, Mascot Daemon

Hlavní výsledky a diskuse

Protokoly potvrzují vysokou reprodukovatelnost frakcionace a konzistentní výkon při identifikaci proteinů i z nízkých množství vzorku. Mikrofluidický čip výrazně zkracuje dobu přípravy a zvyšuje robustnost při dlouhodobém provozu. Porovnání dat svědčí o obdobné citlivosti a rozlišení ve srovnání s konvenčním nanospray systémem.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní řešení „od vzorku k výsledku“ s minimální potřebou manuálních kroků
• Vysoká citlivost a nízké limity detekce pro proteiny v komplexních matrixech (plazma, sérum)
• Opakovatelnost a snadná standardizace laboratorních postupů
• Široké možnosti integrace do existujících proteomických platforem a workflow

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a automatizace přípravy vzorků, rozšíření mikrofluidických čipů s integrovanou částicí pro selektivní obohacení peptidů (např. phosphopeptidy) a nasazení vysokorozlišovacích Q-TOF či Orbitrap instrumentů. Dále se rozvíjí umělá inteligence pro pokročilou interpretaci MS/MS dat.

Závěr

Agilent Protein ID Solutions nabízejí ucelený a flexibilní přístup k proteinové identifikaci pomocí nanospray nebo HPLC-Chip® MS/MS. Kombinace efektivní frakcionace, citlivého tryptického štěpení, spolehlivého čištění peptidů a výkonné datové analýzy umožňuje detailní charakterizaci proteomů s vysokou propustností a robustností.

Reference

• Agilent Technologies: Nanospray and HPLC-Chip/MS Protein Identification Solutions Quick Start Guide, 2005