Human Serum and Plasma Protein Depletion – Novel High-Capacity Affinity Column for the Removal of the “Top 14” Abundant Proteins

Význam tématu

Serum a plazma představují klíčové biologické vzorky pro proteomické studie díky dostupnosti a komplexnosti repertoáru proteinů. Dynamický rozsah koncentrací proteinů však výrazně omezuje detekci nízkoodběrných biomarkerů, protože vysoce abundantní bílkoviny maskují méně zastoupené anality. Efektivní deplece nejhojnějších proteinů proto otevírá možnost hlubšího proniknutí do proteomu a identifikace nových diagnostických či terapeutických cílů.

Cíle a přehled studie

Studie představuje novou vysoce kapacitní afinitní kolonu Agilent MARS Human 14 určenou k selektivnímu odstranění čtrnácti nejabundantnějších proteinů ze séra a plazmy. Cílem je snížit přibližně 94 % celkové proteinové hmoty, zachovat reprodukovatelnost a specifitu po více než 200 analýzách a zlepšit dynamický rozsah pro následné proteomické metody, jako jsou 2D elektroforéza či LC–MS/MS.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lidské plasmy a séra byly čtyřnásobně naředěny pufrem A, filtrovány na 0,22 µm spin-filtru a aplikovány na kolonu MARS Human 14. Pro provozní cyklus se využívá:

• Pufr A: 50 mM fosfátový pufr, 150 mM NaCl, pH 7,4 (nahrání, promývání, reekvilibrace)
• Pufr B: nízké pH s 8 M močovinou (eluce navázaných proteinů)

Instrumentace:

• Agilent 1100 HPLC s binární pumpou, termostatovaným autosamplerem, DAD a fraction collectorem
• Afinitní kolona MARS Human 14 (4,6 × 100 mm)
• Invitrogen precast SDS-PAGE gely (4–20 % Tris-Glycine)
• BCA proteinový test (Pierce) pro kvantifikaci
• Sandwich ELISA pro měření jednotlivých proteinů
• Agilent HPLC-Chip/XCT Ultra Trap a MS/MS na ověření specifity

Hlavní výsledky a diskuse

Kolona Human 14 účinně depletovala cílových 14 proteinů s průměrným odstraněním ~94 % celkové proteinové hmoty. Jednotlivé proteiny vykázaly >98 % účinnost deplece podle ELISA (např. albumin 99,9 %, imunoglobuliny >99 %). chromatogramy z běhů č. 1, 50, 100, 150 a 200 ukázaly stabilitu profilu průtoku a vázané frakce. SDS-PAGE potvrdila absence hlavních abundantních pásů ve flow-through a reprodukovatelné rozdělení po 200 bězích. LC–MS/MS analýza vázaných proteinů odhalila pouze minimální nespecifické vazby, přičemž většinu identifikovaných proteinů tvořily cílové molekuly.

Přínosy a praktické využití metody

Depleční kolona významně rozšiřuje dynamický rozsah pro proteomické analýzy, umožňuje vyšší naložení vzorku v 2D GE i LC–MS a odmaskovává nízkoodběrné proteiny klíčové pro biomarkerové studie. Robustní provoz bez významného poklesu účinnosti přes 200 cyklů přispívá k vysoké reproducibilitě dat mezi vzorky kontrol a pacientů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu deplečních kolón pro další spektrum proteinů a adaptace na automatizované high-throughput platformy. Integrace s dalšími fractionačními technikami a kvalitativními metody (SWATH, DIA) umožní komplexnější proteomické profilování a aplikace v klinických studiích a personalizované medicíně.

Závěr

Agilent MARS Human 14 poskytuje vysoce efektivní, reprodukovatelnou a specifickou depleci 14 nejabundantnějších proteinů ze séra a plazmy, čímž zlepšuje detekci nízkoodběrných biomarkerů a zjednodušuje následné proteomické analýzy.

Reference

1. Szafranski C., Bailey J., Turck C. W., Nicol G., Martosella J., Zolotarjova N. Enhancing analytical access to low-abundant proteins in the human plasma proteome. PharmaGenomics, 2004, s. 40–46.
2. Bjorhall K., Miliotis T., Davidsson P. Comparison of different depletion strategies for improved resolution in proteomic analysis of human serum samples. Proteomics, 2005, 5, 307–317.
3. Chromy B. A., Gonzales A. D., Perkins J. et al. Proteomic analysis of human serum by two-dimensional differential gel electrophoresis after depletion of high-abundant proteins. J. Proteome Res., 2004, 3, 1120–1127.