An Integrated Workflow for Automated Calculation of Antibody‑Drug Conjugate (ADC) Drug‑to-Antibody Ratio (DAR)

Význam tématu

Antibody-drug konjugáty představují moderní a vysoce specifickou kategorii bioterapeutik. Stanovení průměrného poměru počtu molekul cytotoxického činidla k jedné molekule protilátky (DAR) je klíčové pro optimalizaci farmakologických vlastností, bezpečnosti a pro zajištění konzistentní kvality v terapeutickém i průmyslovém prostředí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout plně integrovaný pracovní postup pro automatizovanou přípravu vzorků, LC/MS analýzu a výpočet DAR pomocí Agilent AssayMAP Bravo, MassHunter Walkup a BioConfirm DAR Calculator. Workflow má minimalizovat ruční zásahy, zvýšit průchodnost a zajistit reprodukovatelnost výsledků i pro uživatele bez pokročilých znalostí LC/MS.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo Platform pro automatizovanou redukci a deglykozylaci ADC
• UHPLC Agilent 1290 Infinity II se sloupcem PLRP-S (300 Å, 2,1 × 50 mm, 5 µm)
• TOF LC/MS Agilent 6230 Accurate-Mass s Dual Jet Stream ESI zdrojem
• Software Agilent MassHunter Walkup pro řízení analýzy a BioConfirm DAR Calculator pro automatický výpočet DAR

Použitá metodika

Vzorky ADC byly automaticky redukovány a deglykozylovány na Bravo platformě. Kapilární UHPLC separace probíhala gradientem 0,1 % FA ve vodě a acetonitrilu při 0,5 ml/min. Data byla dekonvoluována algoritmem Maximum Entropy v BioConfirm a pro výpočet DAR použita standardní rovnice váženého průměru relativních podílů jednotlivých konjugátových druhů.

Hlavní výsledky a diskuse

Integrované workflow vykázalo průměrné DAR 3,5 pro intaktní i deglykozylované vzorky a hodnoty 3,2–3,0 pro redukované lehké a těžké řetězce, což bylo v souladu s manuální přípravou. Automatizace snížila variabilitu, zvýšila intenzity signálu a umožnila zpracování až 96 vzorků ve stejném čase jako jednoho.

Přínosy a praktické využití metody

• Reprodukovatelnost výsledků bez nutnosti hluboké LC/MS expertízy
• Výrazné snížení pracovních nákladů a rizika lidské chyby
• Vysoká propustnost díky 96 jamkám a snadná správa vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje real-time monitoring, rozšířené využití strojového učení pro pokročilou dekonvoluci spekter a analýzu glykoformních variací, miniaturizaci procesu a plnou integraci v GMP prostředí. Možné je také rozšíření workflow na jiné typy biokonjugátů.

Závěr

Navržené řešení spojuje Agilent AssayMAP Bravo, Walkup software a BioConfirm DAR Calculator do jediné automatizované platformy. Poskytuje spolehlivou, rychlou a vysoce průchozí metodu pro determinaci DAR ADC s minimem ruční práce a vysokou reprodukovatelností.

Reference

1. Perez H. L. et al. Antibody-drug conjugates: current status and future directions. Drug Discovery Today 2014, 19(7), 869-81.
2. Xu K. et al. Characterization of the drug-to-antibody ratio distribution for antibody–drug conjugates in plasma/serum. Bioanalysis 2013, 5(9), 1057-1071.
3. Beck A. et al. Cutting-edge mass spectrometry methods for the multi-level structural characterization of antibody-drug conjugates. Expert Rev Proteomics 2016, 13(2), 157-183.