STANOVENÍ ORGANICKÝCH KYSELIN V SILÁŽÍCH KAPILÁRNÍ ISOTACHOFORÉZOU A KAPILÁRNÍ ZÓNOVOU ELEKTROFORÉZOU

Význam tématu

Organické kyseliny vznikající při fermentaci siláží (octová, mléčná, propionová, máselná) významně ovlivňují kvalitu krmiva a jeho stabilitu. Rychlé, citlivé a selektivní stanovení jejich koncentrace je nezbytné pro rutinní kontrolu procesů přípravy krmiv a hodnocení výsledné kvality.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat kapilární zónovou elektroforézu (CZE) pro stanovení hlavních organických kyselin v silážích vojtěšky a porovnat ji se standardní kapilární isotachoforézou (CITP). Autoři se zaměřili na zkrácení doby analýzy při zachování separační účinnosti a na posouzení přesnosti obou metod.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků siláže: extrakce 5 g materiálu ethanolem a chloroformem, následná vodní extrakce, homogenizace, filtrace a vhodné ředění.
• Elektroforetická separace: analyzátor ZKI 02 (Labeco) ovládaný programem ITPWin 2.20, FEP kapiláry 160 mm × 0,3 mm I.D.
• CZE: konstantní proud 20 µA (cca 5 kV), nosný elektrolyt 6 mM MES + 4 mM L-histidin (pH 5,9), doba analýzy 7 min.
• CITP: vedoucí elektrolyt 10 mM HCl + 22 mM EACA + 0,05 % HPMC (pH 4,5), koncový elektrolyt 5 mM kyselina kapronová, doba analýzy 21 min.
• Detekce: přímá vodivostní detekce, dávkování vzorku 35 µl pro CITP a 200 nl pro CZE.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární rozsah: CZE 50–500 µmol/l, CITP 40–120 µmol/l.
• Mez detekce/kvantifikace: CZE 3 µmol/l / 10 µmol/l, CITP 2 µmol/l / 5 µmol/l.
• V CZE byly jednotlivé kyseliny dobře odděleny v koncentracích 10–60 µmol/l během 7 min.
• CITP poskytla vyšší citlivost, ale s delší dobou 21 min.
• Srovnání výsledků vedlo k regresní rovnici cCZE = (1,22 ± 0,05)·cCITP – (0,6 ± 0,5), r = 0,962; CZE vykazuje systematicky vyšší hodnoty pro kyselinu mléčnou (P < 0,05).

Přínosy a praktické využití metody

• CZE umožňuje až trojnásobné zkrácení doby analýzy proti CITP.
• Jednodušší příprava vzorků a nižší provozní náklady vhodné pro rutinní sledování fermentace.
• CITP zůstává preferovaná tam, kde je kladen maximální důraz na přesnost stanovení absolutních koncentrací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace odběru vzorků a online monitoring fermentačních procesů.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci širšího spektra organických kyselin.
• Rozšíření aplikace na další potravinářské a krmivářské matrice, včetně mléčných výrobků.

Závěr

Kapilární zónová elektroforéza (CZE) představuje efektivní a rychlou alternativu k CITP pro stanovení hlavních organických kyselin v silážích. Volba mezi CZE a CITP závisí na kompromisu mezi časovou efektivitou a požadovanou přesností. Pro rutinní monitoring fermentačního procesu je CZE výhodnější, zatímco CITP nabízí vyšší přesnost v kritických aplikacích.

Reference

• Flirt O.: Tierrernährung 9, 178 (1937).
• Zimmer E.: Wirtschaftseigenes Futter 12, 299 (1966).
• Richardson A. J., Calder A. G., Stewart C. S., Smith A.: Lett. Appl. Microbiol. 9, 5 (1989).
• Mullin J. W., Emmons D. B.: Food Res. Int. 30, 147 (1997).
• Cunha S. C., Ferreira I. M., Fernandes J. O., Faria M. A., Beatriz M., Oliveira P. P., Ferreira M. A.: J. Liq. Chromatogr. 24, 1029 (2001).
• Wei M. C., Chang C. T., Jen J. F.: Chromatographia 54, 601 (2001).
• Alonso E. V., de Torres A. G., Pavon J. M. C.: Quim. Anal. 17, 167 (1998).
• Sobu Y. M., Yamanaka H., Netto J. Z.: Ecletica Quimica 20, 95 (1995).
• Boček P., Pavelka S., Grígerová K., Deml M., Janák J.: J. Chromatogr. 154, 356 (1978).
• Buchberger W., Klampfl Ch. W., Eibensteiner F., Buchgraber K.: J. Chromatogr., A 766, 197 (1997).
• Vyhláška MZe č. 124/2001 Sb. o požadavcích na odběr vzorků a metodách laboratorního zkoušení krmiv (2001).