Fully automated glycoform profiling and sequence validation of the NIST reference antibody

Význam tématu

Monoklonální protilátky se v bioterapii vyznačují vysokou komplexitou glykozylace a variacemi sekvence jejich polypeptidů. Přesná charakterizace glykosidické struktury a primární sekvence je zásadní pro hodnocení kvality a účinnosti terapeutických mAb. Kompletní automatizovaná glykoformní profilace umožňuje rychlé a spolehlivé hodnocení glykoformního profilu a ověření sekvence, což je klíčové pro vývoj a kontrolu jak inovátorů, tak biosimilars.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je ukázat možnosti nového softwaru BioPharma Compass 2.0 ve spojení s ultra vysokým rozlišením QTOF spektrometrem maXis II pro automatizovanou analýzu referenční protilátky NIST. Studie demonstruje tři komplementární přístupy: analýzu intact masek, subjednotkovou (middle-down) a bottom-up analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• MZ spektrometrie maXis II UHR-QTOF
• UHPLC kolony BEH C4 2.1 x 100 mm 1.7 µm a C18+ 2.1 x 100 mm 1.5 µm
• Softwarové prostředí BioPharma Compass 2.0

Metodika:

• Intact mass screening: rychlé odsolení a analýza intact protilátky s minutovým gradientem
• Subunit domain: enzymatický štěp IdeS (FabRICATOR), redukce DTT a analýza podjednotek Fc/2, LC a Fd
• Bottom-Up: tryptická digesce, chromatografické rozdělení a MS/MS fragmentace pro téměř kompletní pokrytí sekvence

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace hlavních glykoform G0F, G1F a G2F s hmotnostní přesností méně než 2 ppm a detekce nízce abundantního aglykonu
• Subunit domain analýza ukázala kvantifikaci glykosylace a odhalila lysinové odstranění u 91 % protilátky v glykoformě G1F
• Bottom-Up analýza dosáhla 99.5 % pokrytí lehkého řetězce a 96.2 % pokrytí fragmenty LC, což umožnilo detailní validaci primární sekvence

Přínosy a praktické využití metody

Tato kombinace analytických přístupů díky automatizaci zajišťuje vysokou rychlost, reprodukovatelnost a hloubku informací s minimálním manuálním zásahem. Metoda je ideální pro kontrolu kvality v biopharma laboratořích a pro vývoj biosimilars, kde je klíčové potvrzení glykosylace a integrity sekvence.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace technik ETD a MALDI pro rozšířenou charakterizaci posttranslačních modifikací
• Vylepšené algoritmy pro de novo sekvenování a detekci neočekávaných mutací
• Rozšíření 21 CFR Part 11 kompatibility pro regulovaný farmaceutický vývoj

Závěr

Automatizovaná platforma BioPharma Compass 2.0 ve spojení s maXis II UHR-QTOF umožňuje rychlé a komplexní charakterizování mAb. Tři komplementární přístupy poskytují detailní vhled do glykoformního profilu a primární sekvence, čímž podporují efektivní vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Formolo T et al Determination of the NISTmAb Primary Structure ACS Symposium Series Vol 1201 Chapter 1 2015
2. Ayoub D et al Extensive glyco profiling of cetuximab using ESI and MALDI mAbs 2013