MALDI FTMS Imaging Mass Spectrometry of N-glycans as Tissue Biomarkers of Cancer

Význam tématu

Analýza N-glykanů pomocí MALDI FTMS imaging nabízí cenný pohled na složité glykosylační změny v nádorové tkáni.
N-glykanové modifikace proteinů ovlivňují strukturu a funkci proteinů a jsou klíčové pro procesy jako buněčná adheze, migrace či imunitní reakce.
Ve výzkumu rakoviny mohou specifické glykanové vzorce sloužit jako biomarkery pro diagnostiku, prognózu a cílené terapie.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat workflow pro uvolnění, detekci a prostorové vyobrazení N-glykanů z formalin-fixovaných parafínem zabalených (FFPE) vzorků štítné žlázy s anaplastickým karcinomem.
Studie využívá solariX MALDI FTMS platformu pro dosažení vysoké citlivosti a rozlišení N-glykanového spektra přímo na tkáňových řezech.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Deparafinace 5 µm FFPE řezu, antigen retrieval v 10 mM citraconanu (pH 3) při 60 °C.
• Enzymatické uvolnění N-glykanů nanesením rekombinantního PNGase F (0,1 µg/µl), inkubace při 37 °C pod vysokou vlhkostí po dobu 2 hodin.
• Aplikace matrice α-cyano-4-hydroxycinnamové kyseliny (7 mg/ml v 50 % acetonitrilu, 0,1 % TFA) pomocí robotického stříkače.

Instrumentace:

• 7 T solariX MALDI FTMS se zdrojem Smartbeam II laserem.
• TM-Sprayer™ pro uniformní nanášení enzymu a matrice.
• FlexImaging 4.1 pro tvorbu 2D map a vytvoření seznamu iontů.
• GlycoWorkbench 2.0 pro putativní identifikaci glykanů s tolerancí ±5 ppm.
• SCiLS Lab 2016b s algoritmem bisecting K-means pro segmentaci a statistickou analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Ve shodě s cíli bylo detekováno více než 111 unikátních N-glykanových struktur (včetně vysokomannózových, hybridních, komplexních a sialylovaných forem) v rozsahu m/z 1 257–4 000.
Zachování sialových kyselin bylo umožněno díky vysokotlakému koliznímu chladicímu plynu, což vedlo k rovnoměrnému zaznamenání termolabilních glykanů.
Segmentace dat odhalila odlišné glykanové profily ve třech patologických oblastech tkáně: nontumor, anaplastické a nekrotické.
Příkladem jsou strukturální vzorce: vysokomannózový Man9 zvýšený v okolní netumorózní tkáni, biantennární glykan dominantní v nekrotických zónách a fukosylovaný tetrantennární glykan v progresivně malignějších oblastech.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje:

• Analýzu archivovaných klinických FFPE vzorků bez ztráty taxativních informací.
• Vysokou citlivost a rozlišení ve spektrálním okně vhodném pro komplexní glykany.
• Prostorovou lokalizaci glykosylačních změn přímo v tkáňovém kontextu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Rozšíření přístupu na další typy nádorů a patologických stavů.
• Integrace glykomických dat s proteomikou a genomikou pro hlubší molekulární charakterizaci.
• Automatizace a standardizace přípravných a datových postupů pro klinické nasazení.

Závěr

Vyvinuté MALDI FTMS imaging workflow na platformě solariX poskytuje robustní a vysoce citlivou metodu pro prostorové mapování N-glykanů v FFPE tkáních.
Metoda odhaluje heterogenitu glykosylace v mikroprostředí nádoru, což přináší nové možnosti pro biomarkerový výzkum a cílené terapie.

Reference

1. Moremen KW, Tiemeyer M, Nairn AV. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2012;13:448–462.
2. Stanley P, Schachter H, Taniguchi N. In: Varki A, et al., editors. Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor Lab Press; 2009. Chapter 8.
3. Varki A. Glycobiology. 2017;27(1):3–49.
4. Pinho SS, Reis CA. Nature Reviews Cancer. 2015;15:540–555.
5. Powers TW, Neely BA, Shao Y, Tang H, Troyer DA, et al. PLoS One. 2014;9:e106255.
6. Drake RR, Powers TW, Jones EE, Bruner E, Mehta AS, Angel PM. Advances in Cancer Research. 2017;134:85–116.
7. Gorzolka K, Walch A. Histology and Histopathology. 2014;29:1365–1376.
8. Ceroni A, Maass K, Geyer H, Geyer R, Dell A, Haslam SM. Journal of Proteome Research. 2008;7:1650–1659.
9. Lin R-Y. Nature Reviews Endocrinology. 2011;7:609–616.
10. O’Connor PB, Mirgorodskaya E, Costello CE. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2002;13:402–407.