High-performance MALDI imaging analysis of on-tissue digested proteins in mammalian FFPE tissues using the Bruker rapifleX MALDI-TOF/TOF

Význam tématu

Formalin-fixace a parafinové zalití (FFPE) jsou standardními postupy pro dlouhodobé uchování tkání. Přestože umožňují snadné krájení a skladování, vytvářejí křížové vazby a zanechávají parafín, který zasahuje do hmotnostní spektrometrie. Vyvinutá workflow pro MALDI-MSI překonává tyto bariéry a otevírá cestu k prostorovému zobrazení a analýze proteinů přímo v běžně archivovaných vzorcích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout, optimalizovat a ověřit postup pro MALDI-MSI on-tissue tryptické digesce bílkovin ve FFPE vzorcích savčích tkání. Studie demonstrovala:

• odstranění parafínu a reverzi křížových vazeb (antigen retrieval),
• depozici trypsinu a MALDI matrix na tři typy tkání (lidská štítnice, prsa, myší mozek),
• získání MALDI-TOF/TOF dat a jejich analýzu v SCiLS Lab.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow sestával z následujících kroků:

1. Odparafinování: sled etanolových a xylenových lázní při kontrolované teplotě.
2. Antigen retrieval: zahřátí v deionizované vodě v tlakovém hrnci při 110 °C.
3. On-tissue digesce: nanesení porciního trypsinu pomocí HTX TM-sprayer.
4. Matrix aplikace: na podložky stříknutím HCCA roztoku (HTX TM-sprayer).
5. Datová akvizice: MALDI imaging na Bruker rapifleX MALDI-TOF/TOF (pozitivní reflexní mód, 20–25 µm pixel).
6. Histologie: odstranění matrix a následné barvení H&E.

Hlavní přístroje:

• Bruker rapifleX MALDI-TOF/TOF
• SCiLS Lab (statistická analýza a prostorová segmentace)
• HTX TM-sprayer (nanášení trypsinu a matrix)
• NXGEN Decloaking Chamber (antigen retrieval)

Hlavní výsledky a diskuse

Prostorová segmentace a PLSA odhalily jasné rozlišení struktur s nízkou (tuková, pojivová) a vysokou hustotou (nádorové oblasti) ve štítnici i prsu. Zobrazení iontů m/z 644,4 prokázalo rozlišení detailů 40–50 µm. Přes přítomnost složité směsi peptidů bylo pomocí MS/MS přímo in situ identifikováno několik markerů (např. kolagen, aktin, histon). Porovnání MS a MS/MS obrazů potvrzuje vysokou specifitu a odstraňuje interferující isobarické signály.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený protokol umožňuje:

• analýzu dlouhodobě uložených FFPE biobankovaných vzorků,
• prostorovou lokalizaci proteinů s detailní morfologickou korelací,
• rychlejší data acquisition díky rapifleX oproti předešlým generacím MALDI přístrojů,
• MS/MS imaging pro ověření distribuce specifických peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj v oblasti:

• optimalizace protokolů pro minimální delokalizaci peptidů,
• vylepšení prostorového rozlišení pod 20 µm,
• automatizace přípravy vzorků a integrace s AI-podporovanou analýzou,
• komplexní multiplexní zobrazování více molekulárních tříd.

Závěr

Prezentovaná metoda propojuje účinné odparafinování, antigen retrieval, on-tissue digesci a rychlou MALDI-MSI akvizici na instrumentu rapifleX. Workflow poskytuje vysoce kvalitní prostorová data z FFPE tkání s možností in situ identifikace peptidů a otvírá nové možnosti pro výzkum, klinickou patologii a biobankové studie.