Exploring high complexity proteomes with a DIA based quant and ID workflow

Význam tématu

Data Independent Acquisition (DIA) přináší plně opakovatelné a komplexní kvantitativní měření komplexních proteomů ve srovnání s tradičními datově závislými přístupy (DDA). Díky opakovanému snímání celého m/z spektra bez selektivního výběru prekurzorů lze získat úplnější obraz proteomického složení vzorku, vyšší reprodukovatelnost a robustní detekci nízkohodinových změn.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo otestovat výkonnost workflow založeného na DIA pro kvantifikaci a identifikaci ve vysoce komplexních proteomech za pomoci LC-MS/MS platformy nanoElute–impact II Q-TOF. Studie hodnotila:

• Identifikaci a kvantifikaci peptidů a proteinů v modelech HYE110 a HYE124.
• Přesnost a reprodukovatelnost měření napříč technickými replikáty.
• Schopnost detekce malých i velkých fold-change v komplexních vzorcích.

Použitá instrumentace

Pro chromatografii a hmotnostní spektrometrii byly využity následující přístroje a systémy:

• nanoElute nano-UHPLC (Bruker Daltonics) s kolonkou Acclaim PepMap RSLC C18, 75 μm×50 cm, 2 μm částice.
• CaptiveSpray ionizační zdroj s nanoBoosterem pro stabilní ESI(+).
• impact II Q-TOF (Bruker Daltonics) v DIA módu s 28 cykly, šířka oken 24 Da, rozsah m/z 400–1000, rychlost 14 Hz.
• iRT peptidy (Biognosys) pro kalibraci retenčního času.
• Software Spectronaut (Biognosys) pro výběr piků, interní spektrální knihovny a korekci interferencí.
• LFQbench (Johannes Gutenberg University Mainz) pro automatizovanou evaluaci kvantifikace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace: více než 31 000 peptidů a až 3 877 proteinů (HYE110) s 74 % až 91 % kvantifikovatelných proteinů.
• Reprodukovatelnost: průměrné R² ≈ 0,97 na úrovni peptidů i proteinů, medián CV pro lidské proteiny 4 %–8 %.
• Přesnost kvantifikace: log2 poměr lidských proteinů kolem 0, přesnost pro kvasinky a E. coli lepší v umírněných poměrech (HYE124).
• Dynamický rozsah: simultánní kvantifikace lidských proteinů přes pět dekád koncentrací bez prefraxionace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorozběhová identifikace a kvantifikace bez nutnosti DDA měření pro budování knihoven.
• Vysoká robustnost a škálovatelnost pro mezi- i vnitrolaboratorní benchmarking QA/QC.
• Schopnost detekovat malé fold-change i v komplexních směsích, vhodné pro biomarkerové studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další optimalizace DIA oken, hlubší pokrytí vzorků díky vylepšeným spektrálním knihovnám a rozšíření aplikací na glykoproteomiku či analýzu proteoform. Integrace umělé inteligence pro automatickou interpretaci dat a adaptivní řízení metodiky přispěje k dalšímu nárůstu citlivosti a rychlosti analýz.

Závěr

Workflow využívající nanoElute–impact II Q-TOF v DIA módu poskytuje špičkové výsledky v oblasti proteomické identifikace a kvantifikace. Vynikající rozlišení, citlivost a dynamický rozsah spolu s robustním softwarem zaručují vysokou přesnost a reprodukovatelnost měření i pro velmi komplexní vzorky.

Reference

• Pedro Navarro et al. A multicenter study benchmarks software tools for label-free proteome quantification. Nature Biotechnology 34, 1130–1136 (2016).
• Application Note LC-MS89: High-quantification efficiency in plasma targeted proteomics with a full-capability discovery Q-TOF platform. Bruker Daltonics (2017).
• Wang H. et al. Development and evaluation of a micro- and nanoscale proteomic sample preparation method. Journal of Proteome Research 4, 2397–2403 (2005).
• Bruderer R. et al. High-precision iRT prediction in the targeted analysis of data-independent acquisition and its impact on identification and quantification. Proteomics 16, 2246–2256 (2016).
• Kuharev J. et al. In-depth evaluation of software tools for data-independent acquisition based label-free quantification. Proteomics 15, 3140–3151 (2015).