Unleashing the power of HT-DIA acquisition on Orbitrap Exploris 240 MS – Precise and accurate quantitation at 260 SPD

Význam tématu

Rychlé a kvantitativně přesné metody datově nezávislé akvizice (DIA) jsou klíčové pro rozsáhlé proteomické studie a klinické aplikace, kde je třeba zpracovat stovky vzorků s vysokou přesností a reprodukovatelností. Vysoká propustnost (hundreds of samples per day) umožňuje urychlit výzkum biomarkerů a mechanismů onemocnění bez kompromisu na hloubce a spolehlivosti dat.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo otestovat a demonstrovat výkon tří HT-DIA metod s gradienty délky 3,5, 5,5 a 11 minut (odpovídající 260, 170 a 100 vzorků za den) pomocí Orbitrap Exploris 240 a kapilární chromatografie na µPAC Neo kolonce. Studie porovnává proteomickou hloubku, kvantitativní přesnost, technickou reprodukovatelnost a robustnost během 1000 po sobě jdoucích běhů a napříč třemi laboratořemi.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 200 ng HeLa digestu s přídavkem PRTC peptidů pro sledování přesnosti.
• Chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s µPAC Neo high-throughput 5,5 cm kolonkou, tři gradienty (3,5 min/3 µL/min; 5,5 min/1,25 µL/min; 11 min/1 µL/min).
• Mass spectrometrie: Orbitrap Exploris 240 (MS1/MS2 rozlišení 30 000/15 000, rozsah 525–800/825 m/z, DIA okna 8–16 m/z, NCE 28 %).
• Softwarová analýza: Spectronaut 18 (DirectDIA+), DIA-NN 1.8.1 (library-free) a Proteome Discoverer 3.1 s CHIMERYS 2.0, filtrace 1 % FDR.

Hlavní výsledky a diskuse

• Proteomická hloubka: až ~6000 proteinových skupin při 100 SPD, ~4900 při 260 SPD; střední hodnoty peptide-protein identifikací výrazně nad 35000 peptidů.
• Kvantitativní přesnost: směs tří druhů (člověk, kvasinky, E. coli) ukázala experimentální poměry blízké teoretickým (1:1, 1:0,5, 1:4) s úzkou rozdělovací křivkou a CV <10 %.
• Reprodukovatelnost: více než 1000 po sobě jdoucích běhů po dobu 11 dnů bez výměny hardware, RSD proteomového pokrytí ~1,37 %.
• Interlaboratorní robustnost: tři laboratoře (Belgie, Švýcarsko, Německo) dosáhly RSD 4,9–6,7 % pro různé SPD.

Přínosy a praktické využití metody

Propojení rychlé kapilární chromatografie s vysokým rozlišením Orbitrap Exploris 240 a µPAC Neo kolonkou poskytuje vysoce přesnou a stabilní kvantifikaci i u malých množství proteinů v komplexních matrikách. Metoda je vhodná pro velkokapacitní projekty, rozvoj biomarkerů, farmaceutický výzkum a QA/QC v průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj bude směřovat k ještě vyšší propustnosti (>300 SPD) a integraci automatizovaných systémů předzpracování vzorků. Pokročilé algoritmy strojového učení a hluboké neurónové sítě mohou zlepšit identifikaci a kvantifikaci vzácných proteinů, zatímco nové materiály pro kolony mohou zvýšit životnost a stabilitu při vysokých tlacích.

Závěr

Studie ukazuje, že HT-DIA workflow na Orbitrap Exploris 240 s µPAC Neo HPLC kolonkou a Vanquish Neo UHPLC poskytuje vynikající proteomickou hloubku, vysokou kvantitativní přesnost a extrémní robustnost pro rozsáhlé proteomické projekty. Metoda je připravena na náročné aplikace v klinickém a průmyslovém prostředí.

Reference

Žádné