Ultrasensitive Detection and Quantitation of Chloramphenicol using the new Elute UHPLC and EVOQ LC-TQ System

Význam tématu

Chloramfenikol je vysoce účinné širokospektré antibiotikum, jehož přítomnost v potravinách živočišného původu je nežádoucí z hlediska bezpečnosti a legislativy. Detekce stopových hladin v matricích s vysokým obsahem tuků a proteinů, jako je vejce, vyžaduje citlivé a selektivní analytické metody. Moderní systémy UHPLC spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) umožňují splnit legislativní požadavky na nízké limity stanovení a potvrzení identity látky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat ultrasenzitivní metodu pro kvantitativní stanovení chloramfenikolu (CAP) ve vejcích s minimální přípravou vzorku. Analýza využívá nový chromatografický systém Elute UHPLC spojený s trojitým kvadrupólem EVOQ Elite LC-TQ v režimu multiple reaction monitoring (MRM). Studie demonstruje schopnost detekovat a kvantifikovat CAP v rozsahu 0,02–5,0 ppb při splnění požadavků na identifikační body podle nařízení EU.

Použitá metodika a instrumentace

Popis přípravy vzorku:

• Homogenizace 1 g celého vejce s přípravkem PES (pufrovaný roztok NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, pH 7,2).
• Přidání interního standardu (chloramfenikol-d5) a extrakce ultrazvukem.
• Oddělení fáze ethylacetátu, odpaření a rekonstituce do mobilní fáze (90:10 voda:MeOH).

Instrumentace:

• Elute UHPLC s kolonnou Restek Ultra AQ C18 (150 × 2,1 mm, 3 µm), objem injekce 2 µL, průtok 0,3 mL/min, gradient 10–95 % fáze B.
• EVOQ Elite LC-TQ: Heated-ESI, teploty zdroje 350–380 °C, plyn rozptýlení 20–60 jednotek, napětí –4500 V, MRM přechody m/z 320,9 > 152 (kvantifikace), 320,9 > 257 a 320,9 > 194 (kvalifikace), interní standard m/z 325,9 > 157.

Hlavní výsledky a diskuse

Limita kvantifikace (LOQ) byla stanovena na 0,02 ppb, přičemž kvalifikační fragmenty vykazovaly konzistentní iontové poměry s RSD < 15 %. Kalibrační křivka v rozsahu 0,02–5,0 ppb prokázala vynikající linearitu (R² = 0,9967) bez vážení. Opakovatelnost signálů na různých dnech byla velmi dobrá (RSD < 7 %). Chromatografické píky byly ostré (šířka 2,1–2,4 s) a vysoce reprodukovatelné i v náročné matrice vejce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Extrémně nízkou detekční a kvantifikační mez (0,02 ppb) vhodnou pro kontrolu reziduí chloramfenikolu v souladu s EU regulací.
• Rychlou přípravu vzorku a krátké doby analýzy (7 minut běhu UHPLC).
• Spolehlivou identifikaci pomocí MRM přechodů s dostatečnými identifikačními body pro legislativní potvrzení.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj se může zaměřit na:

• Aplikaci metody na další komplexní živočišné matrice (mléko, maso, mořské plody).
• Automatizaci přípravy vzorku a integraci s high-throughput platformami pro hromadné testování.
• Rozšíření detekčního spektra o další zakázané veterinární léky pomocí multi-analyte protokolů.

Závěr

Vyvinutá UHPLC-MS/MS metoda s Elute UHPLC a EVOQ Elite LC-TQ umožňuje citlivou, selektivní a reprodukovatelnou detekci chloramfenikolu ve vejcích na úrovních pod 0,1 ppb. Splňuje přísné požadavky evropských norem na bezpečnost potravin a je vhodná pro rutinní kontrolní analýzy a výzkum.

Reference

• S.R.R. Siqueira et al., Journal of Separation Science 2009, 32, 4012–4019.