High-throughput Mass Spectrometry Analysis of Synthetic Oligonucleotides: A Comparison of Data from Fast LC and RapidFire Methods

Význam tématu

Výroba a analýza syntetických oligonukleotidů hraje klíčovou roli v biochemii, farmaceutickém výzkumu a terapiích založených na RNA a DNA. Zvýšená poptávka po rychlých a spolehlivých metodách analýzy vyžaduje vysoce průtokové a přesné postupy pro desalinizaci a hmotnostní spektrometrii.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je porovnat dvě metody vysokoprůtokové desalinace a analýzy syntetických oligonukleotidů pomocí LC-MS: metodu Fast LC a platformu RapidFire. Obě metody byly optimalizovány na 18mer vzorcích a následně testovány na DNA a RNA 18 až 100 merů dlouhých.

Použitá metodika a instrumentace

• Fast LC: Agilent 1290 Infinity II multi-sampler s duálním vstřikováním, rychlý gradient při vysokém průtoku přes guard kolonu připojenou k MS.
• RapidFire: šestisekundová desalinace a šestisekundové eluční kroky na 4 µl kartridži využívající přepínání pump.
• Detekce: TOF hmotnostní spektrometrie; data zpracována v MassHunter Bioconfirm B07.

Hlavní výsledky a diskuse

• Průtok: RapidFire dosahuje ~15 s na vzorek (~240 vzorků/h), Fast LC ~40 s na vzorek (~90 vzorků/h).
• Reprodukovatelnost: stabilní tlakové profily a chromatografické stopy u 24 replik obou metod.
• Desalting: RapidFire efektivně snižuje podíl solných aduktů (~12–14 %) oproti Fast LC (~25–39 %), především u delších oligonukleotidů.
• Intenzita signálu: RapidFire poskytuje 100 % cílové signály, Fast LC generuje 25–80 % v závislosti na délce oliga.
• Separace: Fast LC umožňuje rozdílné retenční časy a rozlišení směsí, RapidFire eluuje homogenně bez chromatografické separace.
• Analýza nečistot: RapidFire odhalil nízkoúrovňové nečistoty (až ~0,5 %), přehledně dekonvolvované i bez chromatografie.

Přínosy a praktické využití metody

Obě metody umožňují rychlý screening a kontrolu kvality velkých objemů syntetických oligonukleotidů, což je zásadní pro farmaceutický výzkum, vývoj genetických terapií a výrobní procesy s vysokými nároky na produktivitu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace gradientů a parametrů průtoku pro rovnováhu mezi rychlostí a separací.
• Integrace umělé inteligence a pokročilých nástrojů pro analýzu nečistot.
• Rozšíření aplikací na modifikované oligonukleotidy a konjugáty.
• Vývoj miniaturizovaných systémů pro vyšší throughput a nižší spotřebu reagencií.

Závěr

Metody RapidFire a Fast LC poskytují robustní, reprodukovatelné a rychlé řešení pro analýzu syntetických oligonukleotidů. RapidFire vyniká v účinné desalinaci a rychlosti, zatímco Fast LC nabízí výhodu chromatografické separace. Volba metody závisí na požadavcích na throughput, účinnost desalinace a potřebu separace.

Reference

• Poster Reprint ASMS 2020, TP 434, Agilent Technologies.