Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by CZE and CZE/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky podléhají během biosyntézy řadě posttranslačních modifikací, které ovlivňují jejich celkový náboj a elektroforetickou migraci. Rozdíly v nabití mohou měnit biologickou aktivitu, stabilitu a imunogenní vlastnosti terapeutických protilátek. Monitorování heterogenity nábojových variant je proto klíčové pro zajištění shody mezi šaržemi a pro potvrzení kvality biopharmaceutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předloženého Application Note je demonstrovat použití kapilární zónové elektroforézy (CZE) a kombinace CZE s hmotnostní spektrometrií (CZE/MS) pro analýzu nábojové heterogenity inovátoru rituximabu a jeho biosimilárního ekvivalentu. Studie porovnává profil základních, hlavních a kyselých variant a dále charakterizuje základní formy pomocí Q-TOF MS.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit systém Agilent 7100 CE se standardním UV detekcí při 214 nm a kapilárami z fluorovaného kysličníku křemičitého (FSC) a PVA potaženými kapilárami pro CZE/MS. Rozpouštědlo obsahovalo 400 mM e-amino-kyseliny caproové s pH 5.7 doplněné HPMC a TETA. Napětí činilo 30 kV, teplota 20 °C, injekce 5 s při 50 mbar. Pro CZE/MS byl použit Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s ESI ionizací, meziproudovým plynem a kyselinou octovou v metanolu jako plnicím roztokem.

Hlavní výsledky a diskuse

CZE separace ukázala vynikající rozlišení základních, hlavních a kyselých variant rituximabu v čase do 25 min. Reprodukovatelnost migračních časů (RSD 0.12–0.58 %) i ploch (RSD 0.2–1.11 %) byla velmi dobrá. U biosimilárního přípravku převládaly základní varianty, zatímco u inovátoru dominoval hlavní vrchol. CZE/MS dekonvoluce odhalila sérii hmotnostních rozdílů odpovídajících odštěpení C-terminálních lyzinů, což umožnilo detailní charakterizaci molekulárních forem.

Přínosy a praktické využití metody

Kapilární elektroforéza nabízí rychlou, robustní a vysoce účinnou alternativu k izoelektrickému fokusování pro sledování nábojové heterogenity mAb. Metoda umožňuje kvantitativní vyhodnocení variant pro QC procesy i stabilitní studie. Kombinace s MS rozšiřuje možnosti přesné hmotnostní charakterizace proteolytických a modifikačních variant.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj analytiky mAb bude směřovat k integraci CE s vysokorozlišenou MS pro ještě detailnější mapování PTM a glykanových struktur. Automatizace workflow a využití cílené datové akvizice přispějí k vyšší citlivosti a rychlosti analýz. Metodu lze dále aplikovat na vícenásobné modifikované protilátky a konjugáty.

Závěr

Studie potvrdila, že Agilent 7100 CE v kombinaci s UV a Q-TOF MS umožňuje spolehlivou detekci a kvantifikaci nábojových variant rituximabu. CZE poskytuje vysoké rozlišení a reprodukovatelnost, zatímco CZE/MS rozšiřuje analýzu o detailní hmotnostní profilaci.

Reference

• He Y et al Analytica Chemica 2010 82 3222–3230
• He Y et al Journal of Separation Science 2011 34 548–555
• Picometrics webové materiály ke kapilární elektroforéze
• Agilent Technologies Characterization of Monoclonal Antibodies Using CE-ESI-MS publikace 5991-5212EN