NOVÉ POSTUPY DIAGNOSTIKY DĚDIČNÝCH PORUCH PURINOVÉHO A PYREVIIDINOVÉHO METABOLISMU POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY

Význam tématu

Diagnostika dědičných poruch purinového a pyrimidinového metabolismu je nezbytná pro včasné odhalení a léčbu řady genetických onemocnění. Tradiční chromatografické metody jsou časově náročné, drahé a často nedostačujícím způsobem odlišují velké množství molekul přítomných v moči. Kapilární elektroforéza přináší rychlejší, citlivější a selektivnější alternativu při nižších provozních nákladech.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo optimalizovat a porovnat dva separační režimy kapilární elektroforézy pro screening purinových a pyrimidinových metabolitů v moči zdravých jedinců i pacientů s deficity enzymů OTC, PNP a APRT. Studie zahrnovala testování alkalického aniontového módu a kyselého kationtového módu a srovnání s referenční HPLC metodou.

Použitá instrumentace

• Kapilární elektroforéza P/ACE 5510 s diodovým polem detektorem (Beckman Instruments)
• Kapilára křemenná Rp I D 75 µm, Rv 375 µm, délka 47 cm (efektivní 40 cm)
• HPLC Milipore-Waters s UV detekcí současně při 250 a 280 nm
• Kolona Hichrom spherisorb 5 µm ODS-2, 12,5 cm × 4,6 mm

Použitá metodika

Vzorky moči byly po ultrazvukové sonifikaci a odstředění analyzovány dvěma CE režimy:

• Aniontový mód: 0,015 mol·l⁻¹ tetraboritan sodný + 0,080 mol·l⁻¹ SDS, pH 9,5, napětí 15 kV, UV detekce 190–300 nm
• Kationtový mód: 0,200 mol·l⁻¹ fosforečnan sodný, pH 1,8, napětí 18,5 kV, UV detekce 190–300 nm

Kapilára byla mezi cykly důkladně proplachována NaOH a elektrolytem. Dávkování vzorku hydrodynamicky tlakem 4,2 kPa po dobu 1–15 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Aniontový mód umožnil separaci více než 60 složek moči s účinností až 230 000 teor. pater a reprodukovatelností migračních časů do 1 %. Kationtový mód dosáhl účinnosti 108 000 teor. pater bez významných interferencí. Oba režimy jednoznačně identifikovaly akumulované metabolity v moči pacientů s deficitem OTC, PNP a APRT. CE metody vykázaly trojnásobně rychlejší analýzu, až 300× vyšší separační výkon a nižší spotřebu pufrů oproti HPLC.

Přínosy a praktické využití metody

Kapilární elektroforéza nabízí rychlý robustní screening dědičných metabolických poruch s vysokou selektivitou a nízkými provozními náklady. Metoda je vhodná pro rutinní diagnostiku i výzkumné aplikace, umožňuje paralelní monitoring rozsáhlého spektra purinových a pyrimidinových sloučenin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databází migrací a UV spekter pro automatizovanou identifikaci
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro zvýšení selektivity
• Automatizace přípravy vzorků a multiplexní analýzy
• Využití nových kapilárních materiálů a povrchových modifikací pro optimalizaci separace

Závěr

Kombinace alkalického aniontového a kyselého kationtového módu kapilární elektroforézy poskytuje spolehlivý, rychlý a nákladově efektivní nástroj pro diagnostiku dědičných poruch purinového a pyrimidinového metabolismu. Metody výrazně překonávají tradiční HPLC z hlediska rychlosti, selektivity a provozních nákladů.

Reference

• Van Gennip A H, Van Noordeburg-Huistra D Y, De Bree P K, Wadman S K Clin Chim Acta 85 7 1978
• Simmonds H A, Duley J A, Davies P M Techniques in Diagnostic Human Biochemical Genetics A Laboratory Manual Hommes F A 1991
• Bruchelt G, Niethammer D, Schmidt K H J Chromatogr 618 57 1993
• Bory C, Chantin C, Boulieu R J Chromatogr A 730 329 1996
• Ševčík J, Adam T, Mazáčová H Clin Chim Acta 245 85 1996
• Ševčík J, Adam T, Sázel V Clin Chim Acta 259 73 1997