Analysis of Monoclonal Antibody Digests with the Agilent 1290 Infinity 2D-LC Solution

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují složité proteinové bioléčiva s vysokou molekulovou hmotností a širokým rozsahem modifikací a posttranslačních úprav.
Precizní analýza tryptických peptidů je klíčová pro ověření identity, čistoty a stability těchto léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je demonstrovat schopnosti komprehenzivní dvourozměrné kapalinové chromatografie (LC×LC) s využitím systému Agilent 1290 Infinity 2D-LC pro detailní mapování tryptických štěpů trastuzumabu.
Studie se zaměřuje na rozsáhlé rozlišení více než 100 peptidů, včetně identifikace modifikací a nekompletních štěpů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro zpracování vzorků byla použita standardní příprava:

• Redukce disulfidických můstků DTT, alkylace IAA
• Enzymatická digesce trypsinem při 37 °C po 16 hodinách
• Forced degradation: oxidační stres (TBHP) a pH stres (pH 9)

Použitá instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity Binary Pump (1. i 2. dimenze)
• Agilent 1290 Infinity Autosampler s termostatem
• Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment
• Agilent 1290 Infinity Diode Array Detector
• Duo valve pro 2D-LC a smyčkový interface
• Software: Agilent OpenLAB CDS Chemstation s 2D-LC add-on, GC Image LC×LC Edition

Hlavní výsledky a diskuse

Kompletní LC×LC metoda poskytuje vysokou ortogonálnost mezi silově iontovou výměnou (SCX) a reverzní fází (RPLC), což se projevuje rozptylem peptidů po ploše chromatogramu.
Přesnost retenční doby a objemu peptidů (%RSD < 5 %) byla prokázána na pěti opakováních, což potvrzuje robustnost metody pro srovnávací analýzy.
Forced degradation odhalila oxidace methioninu a deamidaci asparaginu, které jsou obtížně oddělitelné v jednorozměrné RPLC.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoké chromatografické rozlišení pro detailní peptide mapping
• Možnost detekce a kvantifikace nízkoúrovňových modifikací
• Robustnost vhodná pro kontrolu kvality a srovnání výroby originálních a biosimilárních produktů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci nových modifikací
• Automatizace a zrychlení analytických postupů
• Využití pokročilých softwarových nástrojů pro zpracování 2D dat a strojové učení
• Rozšíření aplikací na další bioléčiva a komplexní proteinové směsi

Závěr

Komprehenzivní LC×LC na platformě Agilent 1290 Infinity 2D-LC poskytuje vysokou chromatografickou sílu a reprodukovatelnost nutnou pro detailní charakterizaci monoklonálních protilátek.
Metoda je vhodná pro sledování čistoty, identity a stability proteinových bioléčiv v rámci vývoje a kontroly kvality.

Reference

• Sandra K., Vandenheede I., Sandra P. The power of liquid chromatography-mass spectrometry in the characterization of protein biopharmaceuticals. LCGC Europe Supplement, May 2013.
• Francois I., Sandra K., Sandra P. Comprehensive liquid chromatography: fundamental aspects and practical considerations – a review. Analytica Chimica Acta, 2009; 64: 14–31.
• Sandra K. et al. Highly efficient peptide separations in proteomics. Part 2: bi- and multidimensional liquid-based separation techniques. Journal of Chromatography B, 2009; 877: 1019–1039.