Multi-Dimensional LC/MS Using Orthogonal Reversed-Phase Stationary Phases

Význam tématu

Multidimenzionální chromatografie napojená na hmotnostní spektrometrii umožňuje dosáhnout vysoké separace a citlivosti při analýze složitých směsí, jako jsou proteolytické digesty nebo komplexní přírodní produkty. V praxi se využívá ke zlepšení rozlišení látek, které by standardní jednoetapové metody nedokázaly oddělit.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit tři přístupy k multidimenzionální LC/MS s využitím různé či téže stacionární fáze: přidání iontově párovacích činidel na C18, spojení dvou různých kolón (distinkt­ní vs. komplementární fáze) a použití jedné víceinterakční fáze (Discovery HS F5). Demonstrovaným modelem byla analýza tryptického digestu β-galaktosidázy z E. coli.

Použitá metodika a instrumentace

Veškeré experimenty proběhly na kapalinové chromatografii napojené na ESI-MS detektor.

• Stacionární fáze: C18, C8, PFPP (HS F5), SCX, SAX (Supelco).
• Mobilní fáze: 20 mM amonný acetát (pH 6,7) – acetonitril ve vodné matrici (gradient 30–100 % ACN).
• Průtok: 1 mL/min, teplota 35 °C, objem vstřiku 10 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

1D RPLC/MS digestu β-galaktosidázy vykázala široké, překrývající se vrcholy (TIC až 1,2×10^5). Při 2D IEX–RP/LC–MS se komplexita chromatogramu snížila, signál klesl na ~3,8×10^4, ale došlo k lepší separaci více peptidů.
Pro spojení dvou RP fází (C18 vs. C8) nebyly patrné významné výhody – retence a selektivita byly podobné. Naopak při použití komplementární fáze HS F5 se objevily odlišné pořadí eluce a unikátní selektivity pro modelové báze (lidokain, alprenolol, diphenhydramin, verapamil, amitriptylin, nortriptylin).
Jednofázová multidimenzionální chromatografie na HS F5 přinesla „U-shaped“ retenci: při nízkém, středním i vysokém podílu organiky dominovaly různé interakce (disperzní, dipólová, iontově výměnná), což umožnilo oddělit např. verapamil, amitriptylin i clonidin bez nutnosti iontových párů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení složitosti chromatogramu při analýze složitých směsí.
• Možnost eliminovat nevolatilní iontově párovací činidla, která potlačují ionizaci v LC/MS.
• Snížení počtu používaných kolón a zjednodušení instrumentálního uspořádání díky víceinterakčním fázím.
• Širší škála selektivit pro oddělení látek s podobnými fyzikálně‐chemickými vlastnostmi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj nových hybridních stacionárních fází s cíleným designem povrchu pro specifické interakce, automatizovaná optimalizace víceetapových metod pomocí strojového učení, aplikace v proteomice a metabolomice, a integrace s vysokorychlostními hmotnostními analyzátory pro on-line multidimenzionální separace.

Závěr

Multidimenzionální chromatografie nabízí tři hlavní přístupy: přidání iontově párovacích látek, spojení různých kolón a použití jedné víceinterakční fáze. Z praktického hlediska se často nejlépe osvědčí výběr vhodné polar-RP fáze, která kombinuje disperzní, dipólové a iontové interakce, a umožňuje tak robustní a vysoce selektivní separace.

Reference

Bell DS; Wyatt SR. Multi-Dimensional LC/MS Using Orthogonal Reversed-Phase Stationary Phases. Supelco Application Note T403167 GIL, Bellefonte, PA, 2003.
Chen Q. et al. The Pennsylvania State University, proteomic studies of β-galactosidase digests.