HPLC Column Comparison Screening Study for Reversed Phase Columns

Význam tématu

Výběr správné kolonové fáze v HPLC výrazně urychluje vývoj analytických metod, zvyšuje spolehlivost separací a snižuje časové i finanční náklady spojené s optimalizací chromatografických podmínek.

Cíle a přehled studie

• Vyvinout systematický postup pro posouzení selektivity a retence různých obráceně fázových kol (C18, C8, RP-amidové C16, cyano, HS F5).
• Poskytnout screeningová data umožňující rychlý výběr vhodné fáze pro start metodického vývoje.

Použitá instrumentace

• HPLC systém se zabudovaným přepínacím ventilem pro automatické střídání kol
• UV detektor při 220 nm
• Kolony 15 cm × 4,6 mm, částice 5 µm (HS C18, C8, RP-amide C16, cyano, HS F5)
• Mobilní fáze: acetonitril/voda pro neionizovatelné; 25 mM fosfátové pufry pH 2 a pH 7 pro ionizovatelné sloučeniny
• Průtok 1 ml/min, objem injekce 10 µl

Použitá metodika

Testovací směsi zahrnovaly:

• Neutrální sloučeniny: parabeny, alkylbenzeny, funkční benzeny
• Zásadité látky: Mix 1 (jednoduché báze), Mix 2 (farmaceutické báze)
• Kyselé látky: Mix 1 (jednoduché kyseliny), Mix 2 (farmaceutické kyseliny)

Podíl organického modifikátoru byl nastaven tak, aby retenční faktor k’ ležel mezi 1 a 5. Pro ionizovatelné analyty byly použity pufry pH 2 a pH 7. Zaznamenány byly hodnoty k’, faktory chvostění a provedeny korelační analýzy mezi fázemi.

Hlavní výsledky a diskuse

• Korelace C18 vs C8: R2 = 0,9656, selektivita mezi těmito fázemi je velmi podobná.
• Korelace C18 vs HS F5: R2 = 0,7288, HS F5 vykazuje odlišnou selektivitu zejména vůči aromatickým a fluorovaným strukturám.
• Případová studie fenacetinu a kodeinu prokázala, že pH 7 a fáze C18, RP-amide C16, C8 poskytují požadované pořadí eluce (kodein před fenacetinem) s dobrými retenčními parametry.
• Srovnání předpovězených a naměřených hodnot k’ ukázalo odchylky do 20 %, což potvrzuje praktickou spolehlivost screeningu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zrychlení výběru vhodné kolonové fáze a zkrácení doby vývoje HPLC metod.
• Minimalizace počtu experimentálních kroků a spotřeby reagencií.
• Snadná adaptace metodiky při změnách formulace či analyzovaných sloučenin.
• Podpora rozhodování o změně kolony pro dosažení specifické selektivity.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace UHPLC a sub-2 µm částic pro vyšší rozlišení a rychlost analýzy.
• Vývoj nových hybridních a povrchově modifikovaných sorbentů pro rozšířenou selektivitu.
• Implementace chemometrických přístupů a strojového učení pro predikci optimálních chromatografických podmínek.
• Automatizované platformy pro on-line screening kol a mobilních fází.

Závěr

Systematický screening obráceně fázových kol přináší klíčové informace o retenci a selektivitě, usnadňuje rychlý výběr optimální fáze pro různé třídy látek a zjednodušuje vývoj robustních HPLC metod.