Troubleshooting Liquid Chromatographic Separations: Avoiding Common Issues through Informed Method Development Practices

Význam tématu

Správné vývojové strategie HPLC metod umožňují předcházet běžným problémům, jako je špatná separace, deformace špiček, nedostatečné zadržení polárních sloučenin nebo nespolehlivost systému. Metodický přístup šetří čas a zdroje v laboratoři a zvyšuje robustnost a reprodukovatelnost analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Autor dává přehled dvanácti nejčastějších problémů při HPLC a ukazuje, jak je eliminovat pomocí informovaného výběru stacionární fáze, upravené složení mobilní fáze, optimalizace teploty, průtoku i objemu vzorku. Diskutuje alternativy k tradičním C18 fázím a praktické příklady aplikací.

Použitá metodika a instrumentace

• Stacionární fáze: C18 (Discovery, Ascentis), embedded polar group (RP-Amide), fluorované fáze (PFP/F5).
• Mobilní fáze: fosfátové, citrátové, formiátové a acetátové pufry (5–20 mM), organické modifikátory (acetonitril, methanol).
• Detekce: UV (220–270 nm) a MS (ESI+, ESI–, SIR režim).
• Podmínky: gradienty %A/%B, průtoky 0,4–1,5 mL/min, teploty 30–55 °C, injekční objemy 2–25 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

Alternativní fáze RP-Amide zvýšily rozlišení katechinů a kofeinu, zlepšily tvar špiček a snížily problematické interakce se silanolovými centry. Fáze PFP ukázaly výraznou tvarovou a dipólovou selektivitu, využitelnou při separaci isomerů trichothecenů, alkaloidů i vitaminu D. Lineární LSER modely prokázaly rozdíly ve vodivostních, polárních a vodíkových vazbách porovnáním různých stacionárních fází.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlejší vývoj bez nutnosti složitých iontově párovacích nebo vysokopH úprav.
• Robustnější a reprodukovatelnější metody pro analýzy bazických a polárních látek.
• Zvýšená citlivost a nižší detekční limity díky optimalizaci tvaru špiček a kompatibilitě s MS.
• Možnost přímé škálovatelnosti vývoje z analytických na preparativní dimenze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj sub-2 µm a superficially porous částic přinese rychlejší separace s vyšší účinností. Zároveň roste význam HILIC fází pro polární analyty a automatizovaných výběrových nástrojů kolonek. Další optimalizace by mohla vést k cíleným stacionárním fázím pro specifické chemické třídy látek.

Závěr

Informatívní přístup k vývoji HPLC metod, zahrnující detailní znalost mechanizmů interakcí analyty–povrch–mobilní fáze, výrazně minimalizuje běžné chromatografické problémy. Výběr alternativních stacionárních fází RP-Amide nebo PFP/F5 ukazuje cestu k efektivnějším, robustnějším a citlivějším analytickým metodám.

Reference

• Zhao J.H., Carr P.W. Application of retention models in HPLC. Analytical Chemistry. 1999;71(14):2623–2632.
• Euerby M.R., Petersson P. Classification of HPLC columns by chemical interactions. Journal of Chromatography A. 2003;994:13–36.
• Bell D.S., Jones A.D. HPLC separation of ephedra alkaloids. Journal of Chromatography A. 2003.
• Aurand C.R., Bell D.S., Wright M. Separation of vitamin D metabolites on pentafluorophenylpropyl phases. Bioanalysis. 2012;4(22):2681–2691.