The Effect of Ion Pair Reagent on Reversed-Phase Selectivity of Polypeptide Separations

Význam tématu

Reverzní fázová HPLC patří mezi klíčové techniky pro separaci polypeptidů díky schopnosti efektivně rozlišit velmi podobné sekvence a kompatibilitě s vodnými biologickými vzorky. Volba vhodného iontově páracího činidla (TFA, PFPA či HFBA) umožňuje optimalizovat retenci i selektivitu analýzy peptidů, což je zásadní pro proteomiku, farmaceutický výzkum a kvalitativní/kvantitativní kontrolu.

Cíle a přehled studie

Cílem byla systematická studie vlivu různých fluorovaných organických kyselin jako iontově páracích činidel na separaci komerční směsi syntetických peptidů na kolónách Discovery BIO Wide Pore C18. Dále byl zkoumán rozptyl selektivity při separaci angiotensinů při neutrálním pH a rozlišení šestice homologů cytochromu c.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidové vzorky (10–25 µg) byly separovány gradientem na kolónách Discovery BIO Wide Pore C18 (15 cm × 4,6 mm, 5 µm). Proud mobilní fáze 1,0 mL/min, teplota 30 °C, detekce UV při 215 nm. Mobilní fáze obsahovaly 0,1 % TFA, 0,1 % PFPA nebo 0,1 % HFBA v acetonitrilu/vodě. V aplikacích LC/MS se uplatnily no-bleed fáze a SPE na DSC-18 96-well destičkách.

Hlavní výsledky a diskuse

• Porovnání TFA vs. PFPA: změny hydrofobity iontově páracích činidel ovlivnily eluce základních peptidů, zejména u párů podobné báze, kde PFPA prodlužuje retenci vysoce zásaditých komponent.
• Separace angiotensinů I–III při pH 7: na C18 kolóně bylo dosaženo baseline separace i bez kyselého pH, protože ionizace N-terminálního aspartátu angiotensinu II významně snížila jeho retenci.
• Rozlišení homologů cytochromu c: šest isoform o >88 % sekvenční identitě bylo separováno velmi mělkým gradientem, přičemž rozdíly v substitucích amk lokalizované mimo chromatografický povrch zásadně ovlivnily retenční časy.

Přínosy a praktické využití metody

• Umožňuje jemné doladění separace polypeptidů výběrem iontově páracího činidla podle jeho hydrofobních vlastností.
• Kompatibilita s LC/MS zajištěná nízkým uvolňováním fáze a vhodnými pufry.
• Vysoká rozlišovací schopnost i při nízkých koncentracích vzorku díky kapilárním a mikroborovým dimenzím C5/C18 kolón.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace iontově páracích systémů pro rozsáhlé proteomické screeny a peptidová mapování.
• Integrace s vysoce paralelními SPE platformami pro screening klinických vzorků.
• Vývoj nových hybridních fází s rozšířenou pH stabilitou pro širší rozsah biopolymerů.

Závěr

Volba iontově párací látky výrazně ovlivňuje selektivitu RP-HPLC peptidových separací. Studium vlivu TFA, PFPA a HFBA na retenci ukázalo možnost cílené manipulace rozlišení základních i neutrálních polypeptidů. Nové Discovery BIO Wide Pore kolóny nabízejí vysokou stabilitu, citlivost a škálovatelnost pro akademickou i průmyslovou praxi.

Reference