APPLICATION NOTEBOOK - STRUCTURAL ELUCIDATION

Význam tématu

Ion mobility mass spectrometry (IMS) je moderní technika umožňující oddělení iontů na základě jejich tvaru, velikosti a náboje v plynové fázi. Kombinace IMS s vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií UPLC a přesnou hmotnostní spektrometrií TOF přináší další rozměr ortogonální separace, což významně zvyšuje schopnost rozlišit izomery, strukturálně podobné metabolity a lipidy, snižuje počet falešných pozitiv i negativ a zlepšuje kvalitu a spolehlivost dat získaných z biologických matic.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem prezentovaných studií je demonstrovat využití IMS-TOF MS (označované také jako HDMS) a pokročilých režimů fragmentace (HDMS^E a TAP) pro:

• oddělení izobarických a strukturálních izomerů (např. orientin vs. isoorientin, vitexin vs. isovitexin, leucin vs. isoleucin),
• konfirmaci identity metabolitů/lipidů na základě přesné hmotnosti, retenční doby, driftového času a fragmentačních vzorců,
• měření rotačně-průměrné kolizní plochy (CCS) iontů jako nového molekulárního identifikátoru nezávislého na matrici vzorku,
• zjednodušení strukturové elucidace pomocí TAP fragmentace (pseudo-MS³) u komplexních přírodních extraktů,
• ukázku workflow zahrnující analytické i nano-měřítko frakční kolekce (TriVersa NanoMate) pro cílenou izolaci a detailní rozbor komponent v tradičních bylinných extraktech.

Použitá metodika a instrumentace

UL PC podmínky:

• ACQUITY UPLC HSS T3 kolona (2,1×100 mm, 1,7–1,8 μm), teplota 40–65 °C, průtok 0,4–0,7 mL/min, gradient voda/MeOH nebo voda/ACN + 0,1 % FA, doba analýzy 10–20 min.

MS/IMS podmínky:

• Waters SYNAPT G2 (nebo G2-Si) HDMS s organickou ionizací ESI (negativní i pozitivní režim),
• ion mobility separace pomocí T-Wave™ buňky s helium-NYSE akvaduktem, tlak IMS cca 3,4 mbar N₂, T-Wave rychlost 650 m/s, výška 40 V, IMS rozlišení > 40 (Ω/ΔΩ),
• režimy akvizice HDMS^E (DIA nízká a vysoká energie současně) a Time-Aligned Parallel (TAP) pro pseudo-MS³ fragmentaci před a po IMS,
• tri-wave frakční kolektor TriVersa NanoMate pro nanoflow infuzi a cílenou frakční analýzu nízko koncentrovaných složek,
• software pro zpracování: DriftScope™ pro konverzi driftového času na CCS a 4D vizualizaci, DriftScope Data Viewer pro HDMS^E spektra, MassFragment™ pro predikci fragmentačních vzorců.

Hlavní výsledky a diskuse

• Strukturální elucidace lipidů a metabolitů z komplexních matic byla významně zjednodušena díky TAP fragmentačním experimentům, které v jediném kroku generují driftově časově zarovnané první i druhé generace fragmentů (pseudo-MS³),
• zaměření CCS hodnot umožnilo rutinní a velmi přesné (±2 %) měření rotačně-průměrné kolizní plochy iontů v plynu; tyto hodnoty fungují jako nezávislý identifikátor odolný vůči složení matrice,
• CCS filtrace aplikovaná v rutině reziduální analýzy pesticidů snížila falešné pozitivní i negativní nálezy,
• oddělení strukturálních izomerů leucin/isoleucin (rozdíl CCS < 3 Ų),
• analýza flavonoidů (C-glykosidy orientin/isoorientin, vitexin/isovitexin) v extraktu Ficus sp. kombinovala chromatografickou separaci, HDMS^E a CCS/IMS rozlišení, což odhalilo dokonce skrytou souběžně eluující interferenci,
• HDMS^E umožnila selektivní tvorbu fragmentačních spekter bez rušivých přítomných vedlejších iontů v komplexních biologických vzorcích (např. in vivo metabolity buS),
• workflow analytické i nano-frakční kolekce pro cílenou izolaci umožnilo detailní studium minoritních látek při zachování rychlosti a citlivosti.

Přínosy a praktické využití metody

• vysoká rozpustnost metod w.r.t. výzkumných laboratoří: jedno přístrojové řešení pro UPLC, IMS a TOF/MS,
• zvýšená selektivita a špičková peak capacity díky třetí, ortogonální dimenzi (driftový čas),
• nezávislé molekulární potvrzení identity pomocí CCS porovnání s literárními či výpočtovými daty,
• šetrné a rychlé strukturové studie bylin či farmaceutických metabolitů bez nutnosti rozsáhlého přerámcování LC nebo izolace na preparativní úrovni,
• snadné odhalení a vyloučení interferenčnící komponent v komplexních maticích (buňky, tkáň, potraviny),
• jednostopé získání full-scan přesných hmotností i strukturálních fragmentů (HDMS^E) šetří čas i vzorek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj IMS metod směřuje k vyššímu rozlišení driftové buňky, multi-dimenzionálním IMS-IMS separacím a dynamické inteligentní akvizici řízené strojovým učením. Předpokládá se integrace IMS s ultrarychlými chromatografiemi, mikrodialýzními vstupy a rychlými MS-vizualizačními technikami (imaging), což otevře dveře k detailnímu studiu proteinových komplexů, strukturálnímu metabolomickému mapování tkání a řízení procesů v reálném čase.

Závěr

Integrace ion mobility separace s UPLC-TOF MS a víceúrovňovými režimy fragmentace představuje revoluční posun ve strukturní elucidaci metabolitů a lipidů. Přidaná dimenze driftového času a rotačně-průměrná kolizní plocha (CCS) zvyšují selektivitu a důvěryhodnost dat, odstraňují interferenční signály a umožňují efektivní odlišení izomerů. Technologie HDMS a HDMS^E tak tvoří špičkový nástroj pro moderní analytickou chemii, náročné QA/QC postupy i objevitelský výzkum v oblasti metabolomiky a lipidomiky.

Reference

1. Yu K., Castro-Pérez J., Shockcor J. An Intelligent Workflow for Traditional Herbal Medicine Compound Identification by UPLC/TOF-MS. Waters Application Note. 2008;720002486EN.
2. Yu K., Castro-Pérez J., Shockcor J. A Multivariate Statistical Approach using UPLC/TOF-MS for Traditional Herbal Medicine Analysis. Waters Application Note. 2008;720002541EN.
3. Corso R., Almeida R. et al. Automated Nanofluidic System for Real-Time Monitoring of Enzymatic Assay. ASMS 2007 Poster.
4. Prosser S., Eilel D. et al. Optimized Trap and Elute Strategies Using nano-LC-MS/MS for Protein Identification. ASMS 2007 Poster.
5. Kanu A.B., Dwivedi P., Tam M., Matz L., Hill Jr H.H. Ion mobility-mass spectrometry. J Mass Spectrom. 2008;43:1–22.
6. Wyttenbach T., Bleiholder C., Bowers M.T. Factors Contributing to the Collision Cross Section of Polyatomic Ions. Anal Chem. 2013;85(4):2191–2199.
7. Stauber J. et al. On-Tissue Protein Identification and Imaging by MALDI-IMS. J Am Soc Mass Spectrom. 2010;21:338–347.
8. Ponthus J., Riches E. Evaluating IMS-MS for Oil and Petroleum Analysis. Int J Ion Mobil Spec. 2013;16:95–103.
9. Politis A. et al. Integrating IMS-MS with Molecular Modelling to Determine Architecture of Multiprotein Complexes. PLoS ONE. 2010;5(8):e12080.
10. Ruotolo B.T. et al. Evidence for Macromolecular Protein Rings in Absence of Bulk Water. Science. 2005;310(5754):1658–1661.
11. Dear G.J. et al. Sites of Metabolic Substitution: Metabolite Structures via IMS and Modelling. Rapid Commun Mass Spectrom. 2010;24:3157–3162.
12. Cuyckens F. et al. Product Ion Mobility for Assignment of Drug Metabolite Positional Isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 2011;25:3497–3503.
13. Campuzano I., Giles K. SYNAPT G2 High Definition MS: Separation of Natural Product Isomers. Waters Application Note. 2009;720003041EN.
14. da Silva R.Z. et al. Antinociceptive Properties of Orientin from Piper solmsianum. J Nat Med. 2010;64:402–408.
15. Zhang Y. et al. Isolation of Flavones C-glycosides from Bamboo Leaves. Food Chem. 2008;107:1326–1336.
16. Kirchner T. US Patent 5,206,506. 1993.