Optimizing Aggregates Analysis – Mobile Phase

Význam tématu

Chromatografická analýza proteinových agregátů je klíčová pro zajištění kvality terapeutických monoklonálních protilátek. Mobilní fáze významně ovlivňuje interakce proteinů se stacionární fází, tvar píků a rozlišení monomerů od agregátů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat podmínky mobilní fáze při velikostní vylučovací chromatografii trastuzumabu na Nexera Bio UHPLC se sloupcem Shim-pack Bio Diol-300. Hodnocena byla ionická síla (100–250 mmol/l NaCl) a pH (6,0–7,5).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek trastuzumabu (1 mg/ml) byl analyzován izokratickou elucí při průtoku 0,4 ml/min, teplotě 25 °C a UV detekci při 280 nm.
Mobilní fáze: 50 mmol/l fosfátový pufr (NaH2PO4/Na2HPO4) doplněný NaCl na požadovanou ionickou sílu.

Použité přístroje a spotřební materiál:

• Nexera Bio UHPLC, Shimadzu
• Sloupec Shim-pack Bio Diol-300, 300×4,6 mm, 3 μm
• UV detektor (λ=280 nm)
• Amber vial 1,5 ml se septem PTFE/silikon
• Solventní lahve a bezpečnostní uzávěry
• PEEK přípojky

Hlavní výsledky a diskuse

Zvýšená ionická síla mobilní fáze vedla ke snížení elektrostatických interakcí a zlepšení tvaru piků monomeru. Při 200 mmol/l NaCl a pH 7,0 byla dosažena nejlepší symetrie a rozlišení agregátů od monomeru (USP faktor špičatosti ~1,30). Při vyšších koncentracích (≥250 mmol/l NaCl) se projevily vedlejší hydrofobní interakce, které způsobily nárůst komplexity eluce a mírné zhoršení tvaru piků.

Přínosy a praktické využití

Optimalizace mobilní fáze umožňuje robustní a reprodukovatelnou analýzu trastuzumabu, což je zásadní pro kontrolu kvality a kvantifikaci proteinových agregátů ve farmaceutickém vývoji a výrobě.

Budoucí trendy a možnosti využití

Zaměření na vývoj nových stacionárních fází s nízkou nespecifickou vazbou a multimodálních pufrů může dále zlepšit rozlišení a zkrátit dobu analýzy. Integrace s masovou spektrometrií umožní komplexnější charakterizaci variant proteinů.

Závěr

Studie prokázala, že správná volba ionické síly a hodnoty pH mobilní fáze je klíčová pro kvalitní SEC analýzu trastuzumabu. Optimální podmínky (200 mmol/l NaCl, pH 7,0) poskytují vyvážené potlačení elektrostatických interakcí a minimalizaci hydrofobních efektů.

Reference

• Kopaciewicz W., Regnier F. E., Analytical Biochemistry, 1982, 126(1), 8–16.
• Tsumoto K., Ejima D., Senczuk A. M., Kita Y., Arakawa T., Journal of Pharmaceutical Sciences, 2007, 96(7), 1677–1690.
• Golovchenko N. P., Kataeva I. A., Akimenko V. K., Journal of Chromatography, 1992, 591(1-2), 121–128.