Identification of triazolam, etizolam and their metabolites in biological samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry

Význam tématu

Benzodiazepiny patří mezi nejčastěji předepisované léky díky svým sedativním, hypnotickým, anxiolytickým, antiepileptickým a myorelaxačním účinkům. Etizolam a triazolam spolu s jejich metabolity jsou často detekovány v klinických a forenzních biologických vzorcích. Spolehlivá identifikace těchto látek je klíčová pro toxikologii, farmakokinetický výzkum i kontrolu léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce selektivní a citlivou metodu pro simultánní separaci a detekci etizolamu, triazolamu a čtyř hlavních metabolitů v biologických vzorcích. Metoda kombinuje UHPLC s triplekvadrupólovým hmotnostním spektrometrem a využívá MRM přechody s automaticky vyvolávaným MS/MS scanem.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Nexera (Shimadzu, Japonsko)
• Mass spektrometr LCMS-8030 (Shimadzu, Japonsko)
• Kolona YMC-Triart C18, 1.9 µm, 12 nm, 150×2 mm

Použitá metodika

Pro in vitro metabolizmus byly etizolam, triazolam a regenerující systém NADPH inkubovány se S9 frakcí lidské jaterní homogenátu při 37 °C po přibližně 18 hodin. Inkubační směs byla extrahována acetonitrilem, centrifugována, slepena, rekonstituována vodou a filtrovaná 0.2 µm stříkačkovým filtrem. Analýza probíhala na UHPLC s gradienčním programem formic acid/water–acetonitril, průtok 0.3 mL/min, teplota kolony 40 °C a objem injekce 1 µL. Detekce využívala ESI pozitivní ionizaci v režimu multiple reaction monitoring (MRM) s vyvoláním produktových iontových skanů po překročení prahové intenzity.

Hlavní výsledky a diskuse

• Standardní směs (vzorek A) vykázala rozlišení čtyř analytů s optimalizovanými MRM přechody.
• V blank vzorku (C) nebyly pozorovány žádné interference, což dokládá vysokou selektivitu.
• Metabolizovaný vzorek (B) odhalil tři nové chromatografické špičky nad rámec čtyř standardních sloučenin.
• Dva z těchto metabolitů byly identifikovány jako 8-ethylhydroxyetizolam a α-hydroxyetizolam.
• Třetí špička zůstala neznámá.
• MRM trigger scan s následným MS/MS library search potvrdil identitu šesti z celkem sedmi detekovaných sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a spolehlivou simultánní analýzu etizolamu, triazolamu a jejich metabolitů s vysokou specifitou a citlivostí. Je vhodná pro forenzní toxikologii, klinické monitorování terapií benzodiazepiny a rozvoj biofarmakokinetických studií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných benzodiazepinů a jejich metabolitů
• Integrace vysoko-rozlišovací hmotnostní spektrometrie pro nontargeted screening
• Automatizace připravy vzorku a datové analýzy
• Využití v metabolomických studiích a farmakovigilanci

Závěr

Vyvinutá UHPLC–MS/MS metoda s malou částicí kolony prokázala vysoké rozlišení a selektivitu při simultánní detekci etizolamu, triazolamu a jejich metabolitů. Automaticky vyvolávané MS/MS skeny posílily důvěryhodnost identifikace a metoda je plně použitelná pro rychlý screening a kvantifikaci v biologických matricích.