Rapid and Simultaneous Analysis of Plasma Catecholamines and Metanephrines Using Mixed-Mode SPE and Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) for Clinical Research

Význam tématu

Měření plazmatických katecholaminů (dopamin, norepinefrin, epinefrin) a jejich O-methylovaných metabolitů (metanefriny) je v klinickém výzkumu nezbytné pro diagnostiku stavů spojených s dysregulací autonomního nervového systému, včetně feochromocytomů a poruch kardiovaskulárního systému. Vysoká polarita těchto sloučenin činí jejich analýzu výzvou při použití klasických reverzních fází a vyžaduje speciální přípravu vzorku i chromatografickou separaci, která zajistí dostatečné zadržení, rozlišení a citlivost.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo navrhnout rychlou, robustní a současnou kvantifikaci plazmatických katecholaminů a metanefrinů kombinující extrakci pomocí smíšené slabé kationtové iontoměnné SPE ve formátu µElution a chromatografii v režimu hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Studie ověřila linearitu, přesnost a precizi metody při nízkých koncentracích (10–50 pg/mL) a minimalizaci matrice efektů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lidské heparinizované plazmy (250 µL) byly po přidání pufru (50 mM NH4CH3COO) a interního standardu naloženy na Oasis WCX 96-well µElution Plate, kondicionovanou methanolem a vodou. Po dvojí fázi promývání (20 mM NH4CH3COO a 50:50 ACN:IPA) byl sorbent vysušen a anality eluovány v 2 × 25 µL 85:15 ACN:H2O s 2 % kyseliny mravenčí. Chromatografie probíhala na kolonce ACQUITY UPLC BEH Amide (1,7 µm, 2,1 × 100 mm) s gradientem mobilních fází pH 3,0 (amoniakální pufr v H2O/ACN) během 4,0 min. Detekce byla realizována modelem Xevo TQ-S s kladnou ESI a MRM přechody. Data zpracováno v systému UNIFI.

Použitá instrumentace

• Oasis WCX 96-well µElution Plate
• ACQUITY UPLC systém s kolonkou BEH Amide 1,7 µm, 2,1 × 100 mm
• Xevo TQ-S tandemové hmotnostní spektrometr
• UNIFI Scientific Information System

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografická separace zajistila plnou baseline diferenciaci normetanefrinu a epinefrinu, včetně analyzace 3-methoxytyraminu.
• Obnova analyzátů z SPE se pohybovala od 54 % (norepinefrin) do 90 % (dopamin), průměrně 76 %.
• Matrice efekty byly minimální (průměrně –6,9 %), u většiny sloučenin pod –10 %.
• Lineární odezvy v rozsahu 10–2 000 pg/mL (3-MT, MTN, NMT, DA) a 50–10 000 pg/mL (EP, NE), s R2 ≥ 0,999.
• Limit kvantifikace 10 pg/mL pro většinu sloučenin, s přesností a precizností pod 10 %.
• QC vzorky (N=6) ve čtyřech úrovních spikování potvrdily stabilitu, přesnost (±10 %) a opakovatelnost (%CV < 10 %) metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (< 5 min) umožňuje vysokou vzorkovou propustnost v klinických laboratořích.
• Smíšená slabá kationtová SPE v µElution formátu přináší 5× koncentrační obohacení bez nutnosti odpařování.
• HILIC režim na BEH Amide kolonce řeší retenční a separační potíže s vysoce polárními metabolity.
• Minimální matrice efekty a vysoká citlivost přispívají k přesné diagnostice i při nízkých hladinách analyzátů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření HILIC-SPE přístupu na další polar metabolity a endogenní biomarkery.
• Automatizace přípravy vzorku v microplate formátu pro vysokou propustnost.
• Integrace s vysokorozlišovacím MS pro objasnění izobarických interferencí.
• Využití v farmakokinetických a toxikologických studiích pro monitoring neurotransmiterů.

Závěr

Navržená metoda kombinuje smíšenou WF-SPE extrakci a HILIC-UPLC-MS/MS, čímž dosahuje vynikající linearity, přesnosti a citlivosti při současném potlačení matrice efektů. Krátký analytický cyklus a minimální objem eluátu podpoří široké využití v klinickém výzkumu a rutinní diagnostice.

Reference

1. Cubbon S, Antonio C, Wilson J, Thomas-Oates J. Metabolomic applications of HILIC-LC-MS. Mass Spectrom Rev. 2010;29(5):671–684.
2. Jian W, Edom RW, Xu Y, Weng N. Recent advances in application of hydrophilic interaction chromatography for quantitative bioanalysis. J Sep Sci. 2010;33(6-7):681–697.
3. Xu RN, Rieser MJ, El-Shourbagy TA. Bioanalytical hydrophilic interaction chromatography: recent challenges, solutions and applications. Bioanalysis. 2009;1(1):239–253.
4. Jian W, Xu Y, Edom RW, Weng N. Analysis of polar metabolites by hydrophilic interaction chromatography–MS/MS. Bioanalysis. 2011;3(8):899–912.
5. Hemström P, Irgum K. Hydrophilic interaction chromatography. J Sep Sci. 2006;29(12):1784–1821.
6. Danaceau JP, Chambers EE, Fountain KJ. Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) for LC-MS/MS analysis of monoamine neurotransmitters. Bioanalysis. 2012;4(7):783–794.
7. Peaston RT, Graham KS, Chambers E, van der Molen JC, Ball S. Performance of plasma free metanephrines measured by LC-MS/MS in the diagnosis of pheochromocytoma. Clin Chim Acta. 2010;411(7-8):546–552.