Rapid and Simultaneous Analysis of Urinary Catecholamines and Metanephrines Using Mixed-Mode SPE and Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) for Clinical Research

Význam tématu

Analýza močových katecholaminů a jejich O metylovaných metabolitů (metanefrinů) je klíčová pro klinický výzkum v oblastech endokrinologie a neurologie. Tyto látky jsou silně polární a tradiční reversed phase LC MS MS vyžaduje často iontové párování a elektrochemickou detekci, což zvyšuje složitost a ovlivňuje reprodukovatelnost. HILIC chromatografie v kombinaci s mixed mode SPE umožňuje zkrátit dobu analýzy a zlepšit retenci a separaci polarni analyty.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou a současnou metodu pro kvantifikaci šesti klíčových látek z moči dopamin norepinefrin epinefrin 3 methoxytyramin metanephrin a normetanephrin. Studie rozšiřuje předchozí HILIC metodu a analyzuje účinnost extrakce, chromatografické oddělení a matrix efekty při použití UPLC BEH Amide sloupce a Oasis WCX 96 well destiček v kombinaci s Xevo TQD hmotnostním spektrometrem.

Použitá metodika a instrumentace

Popis postupu extrakce a analýzy vychází z následujících kroků

• Predbežná úprava moče kyselinou ledvinovou na pH kolem 1
• Adice interního standardu a prostředku k pufrování vzorku
• Mixed mode SPE extrakce na Oasis WCX 96 well destičkách s promytím a sušením
• Eluce analyzovaných sloučenin 85 15 acetonitril voda s 2 procenty kyseliny mravčí
• Chromatografie na ACQUITY UPLC BEH Amide sloupci při teplotě 30 °C v HILIC módu
• Hydrofilní interakční chromatografie s gradientem dvou mobilních fází s ammonium formiátem
• Detekce pomocí Xevo TQD hmotnostního spektrometru v ESI pozitivním módu a kvantifikace s MRM přechody

Instrumentace

• Acquity UPLC I Class systém
• ACQUITY UPLC BEH Amide Column 1.7 µm 2.1 × 100 mm
• Oasis WCX 30 mg 96 well Plate
• Xevo TQD hmotnostní spektrometr
• MassLynx software včetně TargetLynx modulu

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje dobré retence a baseline separace všech šesti látek s retenčními časy od 0.83 do 1.93 minuty. Kritická dvojice normetanephrin epinephrin byla v HILIC módu oddělena o 0.22 minuty oproti 0.05 minuty v reversed phase. Extrakční výtěžky se pohybovaly mezi 36 procenty pro norepinephrin a 98.5 procenty pro 3 methoxytyramin. Matrix effekty byly sníženy pod minus 10 procent pro většinu analyzů v HILIC módu oproti vysazeným minus 60 procentům v reversed phase. Kalibrační křivky vykázaly lineární odezvu v rozsahu 0.5 až 500 ng mL s koeficientem determinace 0.992 a vyšším. Kovariance kvality QC vzorků byla pod 10 procent pro přesnost i preciznost, což potvrzuje robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rapidní současnou analýzu šesti polarni sloučenin z moči bez použití složitých iontových párovacích činidel. Díky nízkým matrix efektům a vysoké reprodukovatelnosti je vhodná pro klinické studie a diagnostické aplikace. Umožňuje měření endogenních hodnot i zvýšených koncentrací při onemocněních jako feochromocytom a paragangliom.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další polarni metabolity a neurotransmitery
• Automatizace sample preprací v multiwell formátu pro vysokou propustnost
• Integrace do metabolomických studií na bázi HILIC LC MS MS
• Vývoj nových stacionárních fází umožňujících lepší selektivitu
• Adaptace metody pro jiné biologické matrice jako krevní plazma nebo CSF

Závěr

Kombinace mixed mode SPE na Oasis WCX destičkách s HILIC chromatografií na BEH Amide sloupci představuje efektivní a robustní přístup pro simultánní analýzu močových katecholaminů a metanefrinů. Metoda splňuje požadavky na lineární rozsah citlivost selektivitu i reprodukovatelnost a je připravena k nasazení v klinickém výzkumu.

Reference

• Cubbon S et al Metabolomic applications of HILIC LC MS Mass Spectrom Rev 2010 29 671 84
• Jian W et al Recent advances in application of hydrophilic interaction chromatography for quantitative bioanalysis J Sep Sci 2010 33 681 97
• Xu RN et al Bioanalytical hydrophilic interaction chromatography recent challenges solutions and applications Bioanalysis 2009 1 239 53
• Jian W Xu Y Edom RW Weng N Analysis of polar metabolites by hydrophilic interaction chromatography MS MS Bioanalysis 2011 3 899 912
• Hemström P Irgum K Hydrophilic interaction chromatography J Sep Sci 2006 29 1784 821
• Danaceau JP Chambers EE Fountain KJ Hydrophilic interaction chromatography for LC MS MS analysis of monoamine neurotransmitters Bioanalysis 2012 4 783 94