Assay for Identification and Quantification of Host Cell Protein Impurities in High-Purity Monoclonal Antibodies Down to 1 ppm: An Inter-Laboratory Study

Význam tématu

Bioterapeutické monoklonální protilátky se vyrábějí rekombinantními postupy v buňkách producenta, přičemž nízké hladiny vlastních buněčných proteinů (HCP) představují riziko nežádoucích imunitních reakcí. I po několika stupních purifikace může ve finálním produktu zůstat 1–100 ppm HCP, což vyžaduje citlivé a specifické analytické metody odpovídající regulatorním požadavkům.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje mezi­laboratorní studii ověřující generický a vysoce citlivý hmotnostně spektrometrický postup (2D-LC/HDMSE) pro identifikaci a kvantifikaci HCP v čistých monoklonálních protilátkách až do úrovně 1 ppm. Metoda byla validována ve třech nezávislých laboratořích a porovnána s vnitřními standardy.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický protokol zahrnoval přípravu vzorku (denaturace, redukce, alkylace, trypsinová štěpení) s následným odstraňováním surfaktantu a úpravou pH. K frakcionaci peptidů byla použita online dvou­rozměrná kapalinová chromatografie (RP/RP) s on-line naředěním.

• LC komponenty: ACQUITY UPLC M-Class System s 2D Technology; první dimenze XBridge Peptide BEH C18 (1,0×50 mm) při pH 10, kroková gradientní eluční metoda (10 frakcí); on-line naředění 0,1% TFA; zachytávací Symmetry C18 (300 µm×25 mm); druhá dimenze Peptide CSH C18 (300 µm×150 mm) při pH 2,5, 40min gradient.
• MS komponenty: SYNAPT G2-S HDMS s ESI+, ion mobility, HDMSE skenování (rozdělené na nízkoenergetické a vysokoenergetické skeny), drift time-specifické kolizní energie.
• Software: MassLynx v4.1 pro akvizici, ProteinLynx Global SERVER v3.0.2 pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla vysoké reprodukovatelnosti napříč třemi pracovišti: ve všech laboratořích bylo identifikováno 14 společných HCP v koncentracích 1–100 ppm spolu se čtyřmi externími standardy (ADH, PHO, BSA, ENL). Kvantifikace byla založena na intenzitě tří nejlepších peptidů každého proteinu vůči referenčnímu kalibrantu.
Integrace ion mobility významně redukuje komplexitu spekter a zvyšuje kvalitu HDMSE frag­men­tačních dat, což umožňuje spolehlivou identifikaci i velmi nízkých hladin HCP. Pro 11 HCP (2–30 ppm) byly získány „čisté“ MS/MS fragmentační spektra potvrzená kvadrupólovou selekcí a ion mobility separací.

Přínosy a praktické využití metody

• Obecná aplikovatelnost bez nutnosti procesově specifické protilátky (ELISA), šetří čas a náklady na vývoj.
• Vysoká citlivost a dynamický rozsah (4–6 řádů), detekce až 1 ppm HCP ve finálních bioterapeutikách.
• Rychlá adaptace na různé typy produktů a výrobních protokolů bez zásadních úprav metody.
• Umožňuje sledovat HCP spektrum v reálném čase pro lepší kontrolu kvality a splnění regulatorních požadavků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem je zdokonalení citlivosti směrem k sub-ppm úrovním použitím HD-MRM přístupů, automatizace workflow a integrace s pokročilou zpracovatelskou platformou. Rozvoj více rozměrných sekvenčních protokolů a umělé inteligence pro datovou analýzu povede ke hlubší charakterizaci HCP a rychlejší identifikaci rizikových kontaminant.

Závěr

• Prokázána spolehlivá identifikace a kvantifikace HCP při hladinách až 1 ppm v monoklonálních protilátkách.
• Ion mobility-podpořená HDMSE akvizice významně zlepšuje kvalitu dat a rozlišitelnost nízkopoddílových HCP.
• Metoda je rychle přenosná mezi laboratořemi, univerzální pro různé procesy a splňuje regulatorní požadavky.

Reference

1. European Medicines Agency. Omnitrope: Scientific Discussion; 2006.
2. Wang X, Hunter AK, Mozier NM. Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment. Biotechnol Bioeng. 2009;103(3):446–58.
3. Hayduk EJ, Choe LH, Lee KH. A two-dimensional electrophoresis map of Chinese hamster ovary cell proteins based on fluorescence staining. Electrophoresis. 2004;25(15):2545–56.
4. Jin M, Szapiel N, Zhang J, Hickey J, Ghose S. Profiling of host cell proteins by two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE): Implications for downstream process development. Biotechnol Bioeng. 2010;105(2):306–16.
5. Savino E, Hu B, Sellers J, et al. Development of an In-House, Process-Specific ELISA for Detecting HCP in a Therapeutic Antibody, Part 1. BioProcess Intl. 2011;9(3):38–49.
6. Savino E, Hu B, Sellers J, et al. Development of an In-House, Process-Specific ELISA for Detecting HCP in a Therapeutic Antibody, Part 2. BioProcess Intl. 2011;9(4):68–75.
7. Wolters DA, Washburn MP, Yates JR III. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 2001;19(3):242–7.
8. Gilar M, Olivova P, Daly A, Gebler JC. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 2005;77(19):6426–34.
9. Doneanu C, Xenopoulos A, et al. mAbs. 2012;19:242.
10. Schenauer MR, Flynn GC, Goetze AM. Identification and quantification of host cell protein impurities in biotherapeutics using mass spectrometry. Anal Biochem. 2012;428(2):150–7.
11. Doneanu C, Chen W. Analysis of Host-Cell Proteins in Biotherapeutic Proteins by LC/MS Approaches. In Protein Downstream Processing; Methods in Molecular Biology. 2014;1129:341–50.
12. Zhang Q, Goetze AM, et al. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. mAbs. 2014;6(3):659–70.
13. Thomson JH, Chung WK, et al. Improved detection of host cell proteins in a mammalian cell-derived antibody drug using LC/MS with an HCP-enrichment strategy. Rapid Commun Mass Spectrom. 2014;28(8):855–60.
14. Silva JP, Gorenstein MV, et al. Absolute quantification of proteins by LC-MSE: a virtue of parallel MS acquisition. Mol Cell Proteomics. 2006;5(1):144–56.
15. Distler U, Kuharev J, et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 2014;11(2):167–70.