Identification, Quantification and Annotation of Heart Membrane Proteins using Label-Free Nanoscale LC/MS

Význam tématu

Analýza srdečních membránových proteinů je klíčová pro pochopení patofyziologie srdečního selhání a objev biomarkerů spojených s dilatační kardiomyopatií a ischemickou chorobou srdeční. Subproteomové přístupy snižují složitost vzorku a umožňují detekci dosud skrytých proteinů spojených s onemocněním.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo validovat postup obohacení srdečních membránových proteinů pomocí detergentu Triton X-114 a předvést schopnost label-free nanoskopické LC/MS technologie identifikovat, kvantifikovat a anotovat membránové a hydrofobní proteiny. Studie využívá nového datově nezávislého algoritmu pro paralelní fragmentaci více prekurzorových iontů.

Použitá instrumentace

• nanoACQUITY UPLC System s Atlantis® C18 kolonkou 75 μm × 15 cm, 3 μm
• Waters IdentityE High Definition Proteomics System
• Q-Tof Premier Mass Spectrometer pro LC/MSE a DDA experimenty
• Software ProteinLynx Global SERVER v2.3 a IdentityE System pro zpracování dat
• SRS (GO komponentní anotace) a Protalizer pro výpočet GRAVY skóre

Použitá metodika

Vzorkem bylo 250 mg lidské levé srdeční svaloviny, homogenizované v přítomnosti 10% Triton X-114. Fázové separace detergentu a vody probíhaly opakovaně při 4 °C a při 37 °C s následnou acetónovou precipitací, redukcí, alkylací a trypsinovou digescí. LC/MS analýzy proběhly v triplikátu s gradientem 5–40 % acetonitrilu, střídavými kolizními energiemi (5–40 eV) a DDA scanem s dynamickou exkluzí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno celkem 240 proteinů v akvózní fázi a 113 v detergentní, s 60 proteiny detekovanými v obou frakcích.
• Detergentní fáze vykazuje >60 % membránově asociovaných proteinů oproti ~20 % v akvózní fázi.
• Statisticky významný rozdíl v GRAVY skóre potvrzuje účinné obohacení hydrofobních proteinů.
• Technická replikabilita 10–15 % RSD ukazuje na vysokou robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Demonstrovaná workflow umožňuje spolehlivou identifikaci a absolutní kvantifikaci srdečních membránových proteinů bez potřeby značení. Metoda je vhodná pro pilotní studiÍ nastavení počtu vzorků v následných porovnávacích studiích onemocnění versus kontrola a pro objev nových biomarkerů srdečního selhání.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj datově nezávislých akvizičních schémat pro hlubší proteomickou pokrývku.
• Integrace s cílenými kvantitativními přístupy (MRM/SRM) a pokročilými bioinformatickými nástroji.
• Využití v jiných tkáních a typech onemocnění pro objev specifických membránových biomarkerů.
• Implementace strojového učení pro predikci struktury a funkce identifikovaných proteinů.

Závěr

Protokol s Triton X-114 a nanoscale LC/MS poskytuje efektivní obohacení, identifikaci a kvantifikaci srdečních membránových proteinů s vynikající reprodukovatelností. Metoda otevírá cestu k podrobné analýze subproteomu s aplikacemi v biomarker research a molekulární kardiologii.

Reference

• Silva J.C. et al. Quantitative proteomic analysis by accurate mass retention time pairs. Anal. Chem. 2005;77(7):2187–200.
• Silva J.C. et al. Absolute quantification of proteins by LC/MSE. Mol. Cell. Proteomics. 2006;5(1):144–56.
• Hayashi M. et al. A crucial role of mitochondrial Hsp40 in preventing dilated cardiomyopathy. Nat. Med. 2006;12(1):128–32.
• Dos Remedios et al. Nuclear Membrane Proteins in Failing Human Dilated Cardiomyopathy. Proteomics. 2001;1(12):1507–12.