LC/MS Based differential Proteomics of the Mitochondria of [PSI+] and [PSI-] Saccharomyces cerevisiae strains

Význam tématu

Proteomika mitochondrií nabízí komplexní přístup k odhalování proteinového složení a funkce klíčových buněčných energetických center. Prionová forma proteinu Sup35 ([PSI+]) v kvasinkách ovlivňuje respirační kompetenci tím, že modifikuje úroveň mitochondriálně kódovaného Cox2, a proto diferenciální proteomika přispívá k pochopení mechanismů respiračního přepínání.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo kvantitativně porovnat mitochondriální proteomy kmenů Saccharomyces cerevisiae s [PSI+] a [psi-] fenotypem pomocí label-free LC/MSE, a identifikovat proteiny s odlišnou expresí, jež se podílejí na prionově závislých změnách respirační funkce.

Použitá metodika a instrumentace

• Izolace mitochondrií z buněk pěstovaných na glycerolovém médiu.
• Redukce (DTT), alkylace (IAA) a tryptická digestace s následným odstraněním RapiGest.
• Spaření na nanoACQUITY UPLC systému s 1,7 µm BEH C18 NanoEase kolonkou (75 µm × 20 cm) při proudu 250 nL/min.
• Analýza na Waters IdentityE High Definition Proteomics System s Q-Tof Premier MS, střídání nízké (5 eV) a vysoké (15–40 eV) kolizní energie v režimu LC/MSE.
• Zpracování dat a zarovnání prekurzorových a fragmentačních iontů pomocí specializovaných algoritmů.
• Validace vybraných proteinů (Phb1, Phb2) metodou Western blot.

Hlavní výsledky a diskuse

Celkem bylo identifikováno 380 mitochondriálních proteinů, z nichž přibližně 45 % vykazovalo statisticky významnou změnu exprese v kmeni [PSI+]. Nejvýrazněji byly down-regulovány prohibitinové proteiny Phb1 a Phb2, což potvrdily Western blot analýzy. V celkové buněčné frakci exprese Phb1, Phb2 a Cox2 zůstala beze změny, naznačující možnou relokalizaci mitochondriálních proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Label-free LC/MSE kombinuje kvalitativní a kvantitativní analýzu bez potřeby isotopického značení.
• Vysoká reprodukovatelnost chromatografie a přesnost hmotnostních měření zajišťují spolehlivou detekci rozdílů v expresi.
• Metoda je vhodná pro průzkum mitochondriálních funkcí a objevování biomarkerů v biomedicínských i průmyslových aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj hmotnostní spektrometrie (např. DIA, vyšší rychlost MS^n) a pokročilých datových algoritmů podpoří rychlejší a citlivější analýzy. Přenos technologie na klinicky relevantní vzorky a jiné modelové organismy rozšíří možnosti studia mitochondriálních dysfunkcí a vývoje terapeutických cílů.

Závěr

Studie prokázala efektivitu label-free LC/MSE pro identifikaci a kvantifikaci diferencí v mitochondriálním proteomu [PSI+] vs. [psi-] kvasinek. Kombinace s Western blot validací potvrdila spolehlivost zjištěných regulací, zejména u prohibitinů.

Reference

1. A. Chacinska, M. Boguta, J. Krzewska, S. Rospert. Prion-dependent switching between respiratory competence and deficiency in the yeast nam9-1 mutant. Mol. Cell. Biol. 2000, 20, 7220-7229.
2. L.G. Nijtmans, L. de Jong, M. Artal Sanz, P.J. Coates, J.A. Berden, J.W. Back, A.O. Muijsers, H. van der Spek, L.A. Grivell. Prohibitins act as a membrane-bound chaperone for the stabilization of mitochondrial proteins. EMBO J. 2000, 19, 2444-2451.
3. J.C. Silva, R. Denny, C.A. Dorschel, M.V. Gorenstein, I.J. Kass, G.-Z. Li, T. McKenna, M.J. Nold, K. Richardson, P. Young, S.J. Geromanos. Quantitative Proteomic Analysis by Accurate Mass Retention Time Pairs. Anal. Chem. 2005, 77, 2187-2200.
4. J.C. Silva, M.V. Gorenstein, G.-Z. Li, J.P.C. Vissers, S.J. Geromanos. Absolute Quantification of Proteins by LC/MSE; a Virtue of Parallel MS Acquisition. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 144-156.
5. M.A. Hughes, J.C. Silva, S.J. Geromanos, C.G. Townsend. Quantitative Proteomic Analysis of Drug-Induced Changes in Mycobacteria. J. Proteome Res. 2006, 5, 54-63.
6. J.C. Silva, R. Denny, C. Dorschel, M.V. Gorenstein, G.-Z. Li, K. Richardson, D. Wall, S.J. Geromanos. Simultaneous Qualitative and Quantitative Analysis of the Escherichia coli Proteome: A Sweet Tale. Mol. Cell. Proteomics 2006, 5, 589-607.