Comparative LC/MS for Qualitative and Quantitative proteomic anaLysis of tomato-fungus interaction

Význam tématu

Studium interakce mezi plodinami a patogeny na proteomické úrovni umožňuje odhalit mechanizmy obrany a virulence. Label-free nanoskalová LC/MS^E analýza extracelulárního proteomu (apoplastu) rajčete při infekci houbou Cladosporium fulvum nabízí cenné poznatky o časově závislých změnách sekrečních proteinů rostliny i patogenu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo kvantitativně a kvalitativně porovnat proteom apoplastu rajčete od odolných a náchylných linií v několika časových bodech po inokulaci houbou. Studie využila šest podmínek (tři časové body u každé linie), triplikáty měření a kombinaci netargetované LC/MS^E a cílené LC/MS/MS analýzy.

Použitá metodika

Vzorky apoplastu byly připraveny vakuovou infiltrací destilované vody, následně desaltovány, lyofilizovány a redukčně alkylovány. Proteiny byly tráveny trypsinem, extrakty desaltovány SPE fází a koncentrovány. Pro LC separaci byl použit 90minutový gradient (5–40 % acetonitril) při průtoku 250 nL/min.

Použitá instrumentace

• Waters nanoACQUITY UPLC High Definition Proteomics System
• Atlantis 3 µm C18 NanoEase 75 µm × 15 cm nanoskalová kolona
• Q-Tof Premier Mass Spectrometer s přepínáním nízké (5 eV) a zvýšené (25–40 eV) kolizní energie

Hlavní výsledky a diskuse

• Kvalita dat: Koeficient variační (CV) ~70 % shluků měl CV < 15 %, což potvrzuje vysokou reprodukovatelnost mezi injekcemi.
• PCA analýza: První dva hlavní komponenty odlišily vzorky podle inkubační doby a citlivosti linie; triplikáty se shlukovaly těsně vedle sebe.
• Netargetovaná LC/MS^E: Identifikovány proteiny patogen-hostitelské interakce, včetně avirulence (Avr) a extracelulárních (Ecp) proteinů houby a patogenně indukovaných bílkovin rajčete.
• Cílená LC/MS/MS: Pomocí „include listů“ potvrzení klíčových peptidů, např. elicitní protein Phialide, jehož koncentrace v náchylné linii rostla s inkubací.

Přínosy a praktické využití metody

Label-free LC/MS^E poskytuje rychlé, citlivé a rozsáhlé porovnání proteomů bez potřeby značení. Metoda odhaluje časově závislé změny v sekrečních proteinech, umožňuje objevovat biomarkery rezistence a virulence a je aplikovatelná v rostlinné fytopatologii i zemědělském výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databází rajčete a patogenů pro vyšší identifikační pokrytí.
• Integrace de novo sekvenování s netargetovanou analýzou.
• Vývoj rychlých datově řízených pracovních postupů pro reálné časové monitorování infekcí.
• Komplexní multi-omics přístupy spojující proteomiku, metabolomiku a transkriptomiku.

Závěr

Netargetovaná i cílená label-free LC/MS^E analýza umožnila kvantitativní a kvalitativní porovnání extracelulárního proteomu rajčete při infekci Cladosporium fulvum. Metoda prokázala vysokou reprodukovatelnost, citlivost a schopnost detekce klíčových obraných i virulentních proteinů, což podporuje její využití v rostlinné proteomice a zemědělském výzkumu.

Reference

1. Silva JC, Denny R, Dorschel CA et al. Quantitative Proteomic Analysis by Accurate Mass Retention Time Pairs. Anal Chem. 2005, 77, 2187.
2. Silva JC, Gorenstein MV, Li G-Z et al. Absolute Quantification of Proteins by LC/MS^E; a Virtue of Parallel MS Acquisition. Mol Cell Proteomics. 2006, 5, 144.
3. Van den Burg HA, Westerink N, Francoijs K-J et al. Natural disulfide bond-disrupted mutants of AVR4 of the tomato pathogen Cladosporium fulvum ... J Biol Chem. 2004, 278, 27340.
4. America AHP, Cordewener JHG, van Geffen MH et al. Alignment & statistical difference analysis of complex peptide data sets generated by multidimensional LC/MS. Proteomics. 2006, 6, 641.