A COMBINED WORKFLOW FOR IN-DEPTH CHARACTERIZATION OF CYSTEINE-CONJUGATED ANTIBODY DRUG CONJUGATES

Význam tématu

Antibody–drug conjugáty (ADCs) představují moderní terapeutický přístup pro cílenou léčbu nádorových onemocnění. Konjugace cytotoxického ligandu na cysteinové zbytky protilátky umožňuje přesné řízení poměru léku k nosiči (DAR) a lokalizaci vazby. Důkladná charakterizace těchto konjugátů je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti finálního produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout integrovaný analytický pracovní postup pro detailní rozbor cysteinově konjugovaných ADCs. Konkrétně auto­matické stanovení DAR hodnot, rozložení izoform, lokalizace míst konjugace a kvantifikace obsazenosti byly provedeny kombinovanými LC/UV a LC/MS metodami.

Použitá metodika a instrumentace

Analytické kroky byly rozděleny do tří hlavních modulů:

• Intaktní analýza: HIC/UV, SEC-LC/MS a RP-LC/MS na přístrojích Waters ACQUITY H-Class Bio a Xevo G2-S QTof, za použití kolon ProteinPak Hi Res HIC, UPLC Protein BEH C4 a BEH SEC.
• 2D-LC/MS (HIC/RPLC): separace izoform z HIC, následné RP gradientní rozdělení a MS detekce.
• Peptidové mapování (LC/MSE): tryp­tické štěpení, chromatografie na UPLC CSH C18 a vyhodnocení s Xevo G2-XS QTof pro detekci míst konjugace.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání DAR hodnot získaných HIC-LC a SEC-LC/MS ukázalo výbornou shodu ve všech třech hladinách zatížení ligandu. 2D-LC/MS jednoznačně odhalila jednotlivé pozice konjugace („positional isoforms“) a potvrdila přítomnost více subtypů. Peptidové mapování identifikovalo 13 konjugovaných cysteinů s kvantifikací obsazenosti, což umožnilo detailní profilování míry a lokalizace modifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný workflow zabezpečuje:

• Rychlé a spolehlivé určení DAR a rozdělení izoform bez potřeby složité přípravy vzorku.
• Detailní lokalizaci konjugovaných míst pro lepší predikci stability a biologické aktivity.
• Podporu vývoje a kontroly kvality ADC v průmyslových i výzkumných laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je integrace automatizovaných 2D-LC systémů s vyšším rozlišením a hyphenací s novými generacemi QTof či Orbitrap MS. Rozšíření analýzy na glykozylaci a další posttranslační modifikace přispěje k plně komplexnímu charakteru ADC produktů. Aplikace umělé inteligence pro rychlé vyhodnocení výsledků zvýší efektivitu workflow.

Závěr

Prezentovaný kombinovaný pracovní postup pro in-depth charakterizaci cysteinově konjugovaných ADC poskytuje ucelený pohled na DAR, izoformy a místa konjugace. Vysoká míra shody mezi metodami a detailní lokalizace modifikací podpoří vývoj bezpečných a účinných ADC terapií.

Reference

• 61st ASMS conference, poster TP236: Metodika HIC-UV, SEC-LC/MS a RP-LC/MS.
• 61st ASMS conference, poster T2265: Detailní popis 2D LC/MS analýzy.