LOCALIZING THE CONJUGATION SITES OF CYSTEINE-CONJUGATED ANTIBODY DRUG CONJUGATES BY IMPROVED LC-MS SUBUNIT ANALYSIS FOR ADC POSITIONAL ISOMER IDENTIFICATION

Význam tématu

Subunitní LC-MS analýza cysteinově konjugovaných ADC poskytuje detailní informace o pozici konjugace a o vedlejších modifikacích (oxidace, ztráta vody, otevření disulfidů), které nejsou dostupné z intaktní hmotnostní analýzy ani z peptidového mapování.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat účinnost enzymatických protokolů IdeS, SpeB a limitované digesce Lys-C pro uvolnění subjednotek hinge regionu ADC a lokalizaci pozičních izomerů konjugace cysteinu.

Použitá metodika a instrumentace

Enzymatická příprava vzorků:

• IdeS a SpeB (100 U, 30 min při 37 °C), částečná redukce DTT.
• Limitovaná digesce Lys-C (optimalizovaný poměr enzym/ADC, 30 min, ukončeno kyselinou octovou).

Instrumentace:

• LC: Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio, kolona Protein BEH C4 300 Å, 1,7 µm, 2,1×50 mm.
• MS: Waters Xevo G2-S QTof a Xevo G2-XS QTof.
• Mobilní fáze: voda; ACN/IPA 60:40; 1 % FA; 1 % TFA.
• MS podmínky: kapilára 3 kV, konus 150 V, teplota zdroje 500 °C, desolvatace 350 °C, tok plynu 800 L/h.

Hlavní výsledky a diskuse

• IdeS generuje očekávané fragmenty (LC, Fc/2, Fd) pod nízkým sterickým namáháním, ale při vyšším naložení drogy je štěpení omezené.
• SpeB štěpí nad i pod hinge regionem, avšak u vysokého zatížení drogy se objevuje inhibice tvorby subjednotek a vrchol H*** s třemi drogovými molekulami.
• Limitovaná digesce Lys-C prokázala nejvyšší účinnost ve všech variantách zatížení, spolehlivě uvolňuje subjednotky hinge regionu.
• Cílené middle-down MS/MS potvrdilo poziční izomery, oxidaci, ztrátu vody a otevření disulfidů na fragmentech Fc a LC+drug.

Přínosy a praktické využití metody

• Přesná lokalizace konjugace cysteinu u ADC usnadňuje vývoj a kontrolu kvality nových biokonjugátů.
• Metoda podporuje robustní screening variačních izomerů a modifikací v biotechnologickém i farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace dalších specifických proteáz a automatizovaných workflow pro zvýšení propustnosti analýzy, rozšíření middle-down MS/MS strategií pro komplexní mapování izomerů a modifikací, a aplikace v klinické kontrole kvality ADC.

Závěr

Limitovaná digesce Lys-C se jeví jako nejefektivnější přístup k uvolnění subjednotek hinge regionu ADC ve srovnání s IdeS a SpeB, což umožňuje přesnou identifikaci míst konjugace cysteinu a potvrzení pozičních izomerů pomocí cílených MS/MS experimentů.