A COMBINED WORKFLOW FOR IN-DEPTH CHARACTERIZATION OF CYSTEINE-CONJUGATED ANTIBODY DRUG CONJUGATES

Význam tématu

Antibody–drug konjugáty (ADC) kombinují cílené protilátky s cytotoxickými látkami a představují pokročilou třídu bioterapeutik. Jejich složitá struktura a heterogenita kladou vysoké nároky na kvantitativní a kvalitativní kontrolu klíčových parametrů (DAR, distribuce nálože, místa konjugace). Integrovaný analytický workflow zajišťuje komplexní profilaci těchto kritických kvality a podporuje vývoj i rutinní výrobu ADC.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo navrhnout a ověřit kombinovaný analytický přístup pro detailní charakterizaci cysteinových ADC. Hlavní body:

• Automatizované stanovení DAR a rozdělení nálože pomocí HIC-UV a SEC-LC/MS.
• Identifikace pozičních izomerů prostřednictvím on-line 2D LC/MS (HIC/RPLC).
• Subjednotková analýza (HC, LC, Fab) s RPLC-UV a RPLC-MS pro porovnání šarží.
• Peptidová mapování s LC/MSE k lokalizaci a kvantifikaci kongugovaných cysteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup kombinoval následující techniky:

• HIC-UV a SEC-LC/MS pro stanovení DAR a distribuce nálože na intact úrovni.
• On-line 2D LC/MS (HIC/RPLC) pro eluce a analýzu pozičních izomerů.
• Subjednotková separace a analýza (RPLC-UV, RPLC-MS) pro rychlé srovnání vzorků.
• Reverzní fáze peptidová mapování a LC/MSE pro detailní identifikaci a kvantifikaci konjugovaných peptidů.

Použitá instrumentace

Hlavní přístroje a činidla:

• LC: Waters ACQUITY H-Class Bio (s 2D technologií pro HIC/RPLC).
• MS: Waters Xevo G2-S QTof a Xevo G2-XS QTof s nastavením kapiláry 3 kV, desolvační teplota až 350 °C.
• Kolony: Protein Pak Hi Res HIC, ACQUITY UPLC Protein BEH C4, ACQUITY UPLC Protein BEH SEC, ACQUITY UPLC CSH C18.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Automatické měření DAR ukázalo výbornou shodu mezi HIC-UV a SEC-LC/MS pro tři různé vzorky.
2. 2D LC/MS umožnila separaci a dekonvoluci pozičních izomerů, rozlišení až tří odlišných forem per DAR frakci.
3. Subjednotková analýza odhalila sedm hlavních špiček odpovídajících různým isoformám a potvrdila homogennost šarží.
4. Peptidová mapování s LC/MSE identifikovala 13 konkrétních cysteinových míst s určenými poměry obsazenosti.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a automatizovaná kvantifikace DAR a distribuce nálože.
• Nezpochybnitelná identifikace pozičních izomerů pro kontrolu kvality.
• Detailní lokalizace a kvantifikace míst konjugace podporuje vývoj přesných ADC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na ADC s různými typy linkerů a cytotoxických molekul.
• Integrace pokročilých MS/MS technik pro hlubší strukturální informace.
• Aplikace reálného času pro monitorování výrobních procesů ADC.

Závěr

Navržený kombinovaný analytický přístup dokáže komplexně charakterizovat cysteinové ADC na několika úrovních. Poskytuje spolehlivé a reprodukovatelné údaje o DAR, pozičních izomerech a místech konjugace, což významně podporuje vývoj i bezpečnost bioterapeutik.

Reference

• 61st ASMS conference, poster number TP236: Podrobný popis HIC-UV, SEC-LC/MS a RP-LC/MS analýzy ADC.
• 61st ASMS conference, poster number T2265: Detailní studie 2D LC/MS workflow pro pozicní izomery ADC.