UTILISING MIXED MODE μELUTION SPE FOR THE LC-MS/MS ANALYSIS OF STEROID HORMONES IN SERUM FOR CLINICAL RESEARCH

Význam tématu

Precizní a citlivá analýza steroidních hormonů testosteronu a androstenedionu je klíčová pro výzkum metabolických poruch a endokrinních onemocnění. LC-MS/MS poskytuje potřebnou selektivitu a citlivost, přičemž kvalita přípravy vzorku zásadně ovlivňuje spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a validovat analytickou metodu kombinující mixed-mode µElution SPE (Oasis MAX) s LC-MS/MS na platformě Waters ACQUITY UPLC I-Class a Xevo TQD pro kvantifikaci testosteronu a androstenedionu v lidském séru s vysokou přesností a opakovatelností. Metoda byla hodnocena na referenčních CDC HoSt vzorcích a porovnána s existujícími LC-MS/MS postupy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky séra byly předanalyticky ošetřeny metanolem, amoniem a zinkem pro precipitaci proteinů, doplněny vnitřními standardy (13C3 testosteron, 13C3 androstenedion) a automaticky extrahovány s použitím Tecan Freedom Evo 100 a Oasis MAX µElution SPE ve formátu 96-well. Chromatografie probíhala na Waters ACQUITY UPLC I-Class se C18 kolonkou (2.1×50 mm, HSS SB) při gradientu vody, methanolu a amoniového acetátu. Detekce byla realizována na Xevo TQD pomocí MRMs přechodů pro analyty a jejich kvalifikátory.

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah metody dosahuje 0,05–15 ng/mL (r2>0,994), LOD cca 0,025 ng/mL (RSD<20%). Matrixový faktor ukázal potlačení ionizace ~33 % pro testosteron a ~23 % pro androstenedion, přičemž interní standard kompenzoval vliv matrice. Celková přesnost a opakovatelnost byla ≤4,7 % RSD napříč nízkými, středními i vysokými QC úrovněmi. Porovnání s nezávislou metodou (n=35) prokázalo vysokou korelaci (testosteron: y=1,07x+0,01; androstenedion: y=0,96x+0,02) bez významného biasu u androstenedionu a mírnou proporcionální odchylku u testosteronu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou propustnost a automatizaci přípravy vzorku, vynikající selektivitu a citlivost ve fyziologickém rozsahu hormonů. Je vhodná pro klinické výzkumné laboratoře, studie endokrinních poruch, QA/QC procesy a validaci výrobků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření techniky na širší panel steroidů, integrace do víceparametrových endokrinních profilů a další úpravy přípravné fáze pro zvýšení rychlosti a snížení spotřeby eluentů. Automatizace a pokročilé SPE materiály přinesou vyšší propustnost a odolnost vůči matrice.

Závěr

Vyvinutá metoda založená na Oasis MAX µElution SPE a LC-MS/MS pro analýzu testosteronu a androstenedionu poskytuje vynikající citlivost, přesnost a opakovatelnost při nízkých koncentracích v séru, čímž naplňuje požadavky klinického výzkumu a standardizačních programů.

Reference

• Häggström M, Richfield D (2014) Diagram of the pathways of human steroidogenesis. Wikiversity Journal of Medicine 1(1).