Complete Characterization of a Cysteine- linked Antibody-Drug Conjugate Performed on a Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with High Mass Range

Význam tématu

Antibody–drug conjugáty (ADCs) představují moderní třídu biologických léčiv, která kombinují cílenou specificitu protilátky s cytotoxickou aktivitou navázaného léčiva. Kompletní charakterizace těchto komplexních molekul je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti v preklinické i klinické fázi vývoje.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat plnou analýzu cysteinem navázaného ADC Brentuximab-vedotin za použití nové kombinace vysokomassového LC–MS přístupu a peptidového mapování. Autoři upravili softwarové řízení orbitrapového spektrometru pro nativní analýzu intact proteinů a porovnali výsledky s konvenčním denaturačním režimem.

Použitá metodika a instrumentace

Autoři pro intactní nativní LC–MS využili online desalting velikostně vylučovací chromatografií (Waters BEH SEC 4.6×150 mm, 50 mM NH4OAc) připojenou k orbitrapu s High Mass Range (HMR) módem.
Pro denaturační intactní analýzu a peptidové mapování použili reversed-phase kolony MAb-Pac RP a Acclaim RSLC C18 při gradientu ACN/Formic acid na UHPLC Vanquish.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Q Exactive Plus a Q Exactive HF vybavené HMR módem
• UHPLC Vanquish s kolonkami MAb-Pac RP a Acclaim RSLC C18
• Size-exclusion kolona Waters BEH SEC 4.6×150 mm
• Software Thermo Scientific BioPharma Finder s algoritmem ReSpect a Sliding Window dekonvoluce

Hlavní výsledky a diskuse

Native LC–MS intact analýza odhalila osm různých DAR forem (0–8 vcMMAE), střední DAR hodnotu 4,07 odpovídající literatuře. ReSpect dekonvoluce a Sliding Window integrace zachytily i nízkomolekulární ztráty ~762 Da. Denaturační LC–MS umožnila získat MS/MS spektra HCD fragmentací a dosáhnout 99% sekvenční pokrytí v 90min gradientu.
Peptidové mapování identifikovalo všechny čtyři typické Cys konjugace v oblasti hinge peptidu THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK, přičemž nárůst hydrofobnosti s počtem linker-drugů způsobil posun retenční doby. HCD fragmenty přinesly signatury pro vcMMAE (m/z 718, 762 Da ztráty) usnadňující automatickou detekci konjugovaných peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný přístup intact + peptide mapping šetří čas a materiál díky jednomu LC–MS běhu
• Native LC–MS zachovává nekovalentní interakce, důležité pro ADC strukturu
• HCD signatury linker-drugů zvyšují jistotu lokalizace konjugace

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj technik IM-MS pro rozlišení izobarických forem, zavedení AI-podpory pro dekonvoluci komplexních spekter a expanze na další typy ADC se speciálními linkery slibuje zvýšit přesnost a rychlost charakterizace nových bioterapeutik.

Závěr

Studie prokázala, že úprava orbitrapových spektrometrů pro nativní režimy a kombinace s HCD-MS/MS peptidovým mapováním poskytuje komplexní a spolehlivou charakterizaci cystein-vázaných ADC. Metoda umožňuje detailní určení DAR, lokalizaci konjugací a zachycení strukturních detailů relevantních pro vývoj a QC.

Reference

1. Janin-Bussat MC, Dillenbourg M, Corvaia N, Beck A, Klinguer-Hamour C. Characterization of antibody drug conjugate positional isomers at cysteine residues by peptide mapping LC-MS analysis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2015 Feb 15;981-982:9-13.
2. Debaene F, Boeuf A, Wagner-Rousset E, Colas O, Ayoub D, Corvaïa N, Van Dorsselaer A, Beck A, Cianférani S. Innovative native MS methodologies for antibody drug conjugate characterization: High resolution native MS and IM-MS for average DAR and DAR distribution assessment. Anal Chem. 2014 Nov 4;86(21):10674-83.