High-throughput and Sensitive Size Exclusion Chromatography (SEC) of Biologics Using Agilent AdvanceBio SEC Columns

Význam tématu

Biologické léčivé látky jako monoklonální protilátky (mAbs) a protilátkou navázané konjugáty (ADCs) jsou klíčové v moderní farmaceutické praxi, avšak jejich sklony k tvorbě agregátů mohou vést k nežádoucí immunogenicitě a ovlivnit kvalitu přípravku. Rychlá a citlivá analýza velikostní distribuce je proto zásadní v každé fázi vývoje, výroby a kontroly kvality.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na ověření nových Agilent AdvanceBio SEC kolon (300 Å, 2,7 µm, délky 150 mm, průměry 7,8 a 4,6 mm) pro vysokokapacitní, citlivou a reprodukovatelnou separaci a kvantifikaci mAbs a ADCs za méně než 4 minuty. Součástí je i detekce agregátů vytvořených stresovými podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC systém (čerpadlo G5611A, autosampler G5667A, termostat G1330B, termostatovaná kolona G1316C, DAD G4212B)
• Kolony AdvanceBio SEC 300 Å, 2.7 µm: 7.8×150 mm (PL1180-3301) a 4.6×150 mm (PL1580-3301)
• Mobilní fáze: 150 mM fosforečnan sodný, pH 7,0; izokratický režim
• Parametry: 1 mL/min (7.8 mm), 0,35 mL/min (4.6 mm); injekční objem 5 µL (7.8 mm), 2 µL (4.6 mm); detekce 220/280 nm
• Příprava stresovaných vzorků: cyklické změny pH (1→10→6) a inkubace při 60 °C

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrace pomocí standardů (1 kDa–670 kDa) s lineárním vztahem logMW vs retenční objem (R² > 0,984) definovala rozsahy analýzy
• Separační doba pod 4 minuty; užší 4,6 mm kolona projevila vyšší citlivost a lepší rozlišení
• Preciznost (RSD) retenčního času ≤ 0,02 % a plochy ≤ 0,21 % potvrzuje opakovatelnost
• Detekční limity: LOD 31,2 ng, LOQ 62,4 ng (4,6 mm kolona); lineární rozsah 15,6–2000 µg/mL, R² > 0,999
• Stresové studie odhalily jasně oddělené píky agregátů a fragmentů s klesající výškou monomeru po ošetření

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza (<4 min) pro rutinní QC, lot release a stabilitu
• Výborný tvar píků bez organických přísad i u hydrofobních ADC
• Vysoká citlivost umožňuje detekci stopových množství
• Jednoduché nasazení v GMP prostředí pro in-process a finální kontrolu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro podrobnější charakterizaci frakcí
• Miniaturizace a automatizace pro další zvýšení propustnosti
• Rozšíření metodiky na jiné biologické makromolekuly s větší heterogenitou
• Využití v rychlých screeningových a release testech

Závěr

AdvanceBio SEC kolony s částicemi 2,7 µm přinášejí rychlou, citlivou a spolehlivou analýzu mAbs a ADCs do 4 minut, umožňují přesné monitorování agregace i degradace a jsou ideální pro rutinní kontrolu kvality a vývoj biologických léčiv.

Reference

• Fekete S., Beck A., Veuthey J.-L., Guillarme D. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 101, 161–173.
• Kükrer B., Filipe V., van Duijn E., Kasper P. T., Vreeken R. J., Heck A. J. R., Jiskoot W. Mass Spectrometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody Aggregates Fractionated by Size-Exclusion Chromatography. Pharm. Res. 2010, 27, 2197–2204.
• Coffey A. Fast, High-Resolution Size Exclusion Chromatography of Aggregates in Biotherapeutics; Application note, Agilent Technologies, Inc. 2015.