Analysis of PEGylated Proteins with Agilent AdvanceBio SEC Columns

Význam tématu

PEGylace terapeutických proteinů zásadně zlepšuje jejich stabilitu, rozpustnost a prodlužuje biologický poločas v organismu. Díky snížení imunogenicity a ochraně před proteázami je PEGylace široce využívaná v biotechnologickém vývoji a farmaceutickém průmyslu. Spolehlivá analýza čistoty, monomeru a agregátů PEGylovaných proteinů je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje vývoj jednoduché, citlivé a kvantitativní metody velikostní exkluzní chromatografie (SEC) pro stanovení čistoty a agregace PEGylovaného granulocytárního kolonie stimulujícího faktoru (PEG GCSF). Zaměřuje se na použití Agilent AdvanceBio SEC sloupce s vodnou mobilní fází bez organických modifikátorů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup byl proveden na úplně biokompatibilním Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC systému s následujícím vybavením:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC Pump, autosampler a termostatizovaná kolumna
• Detektor DAD VL s bio-inertní kuvetou (10 mm)
• Agilent AdvanceBio SEC, 130 Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm
• Mobilní fáze: 150 mM sodného fosfátového pufru pH 6,8
• Průtok: 0,8 mL/min, objem injekce: 10 µL, detekce UV při 214 a 280 nm
• Agregáty připraveny zahříváním 2 mg/mL PEG GCSF při 55 °C po dobu 60–180 min

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla výborné linearity v rozsahu 12,5–2000 µg/mL (R² = 0,9994). LOD a LOQ byly 3,125 µg/mL a 12,5 µg/mL. Preciznost retence monomeru byla RSD 0,023 % a preciznost plochy vrcholu 0,081 %. AdvanceBio SEC sloupec úspěšně oddělil monomer, dvě frakce agregátů i destabilizované vzorky po stresových studiích. Při zahřívání vzorků se podíl agregátů zvýšil až na 30 % po 180 min, což ilustruje citlivost a rozlišovací schopnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Analýzu bez potřeby organických modifikátorů, šetrnou k proteinům
• Vysokou reprodukovatelnost (nízké RSD) a citlivost (nízké LOD/LOQ)
• Rychlou a jednoduchou přípravu pro rutinní QC
• Spolehlivé monitorování stability a agregace PEGylovaných bílkovin

Budoucí trendy a možnosti využití

Některé perspektivní směry rozvoje:

• Integrovaná detekce s více detektory (MALS, DLS) pro přesnější charakterizaci
• Automatizace a high-throughput formáty analýzy
• Optimalizace metodiky pro různé typy PEG-modifikací a alternativní polymery
• Vývoj online monitorovacích systémů pro kontinuální kontrolu výroby

Závěr

Vyvinutá SEC-HPLC metoda s Agilent AdvanceBio SEC sloupcem nabízí robustní, citlivé a kvantitativní stanovení čistoty a agregace PEGylovaných proteinů. Splňuje požadavky legislativních monografií a je vhodná pro rutinní QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

• Gaberc-Porekar V.; Zore I.; Podobnik B.; Menart V. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2008, 11, 242–250.
• ipc.nic.in/writereaddata/monoprepimages/Pefilgrastim-2961377726.pdf
• Ratto J.J.; O’Connor S.R.; Distler A.R.; Wu G.M.; Hummel D.; Treuheit M.J.; Herman A.C.; Davis J.M. Ethanol-sodium chloride-phosphate mobile phase for size-exclusion chromatography of poly(ethylene glycol) modified proteins. Journal of Chromatography A, 1997, 763, 337–344.
• Arakawa T.; Ejima D.; Tsumoto K.; et al. The Critical Role of Mobile Phase Composition in Size Exclusion Chromatography of Protein Pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2010, 99, 1674–1692.