Size Exclusion Chromatography of Biosimilar and Innovator Insulin

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) je základní analytická technika pro stanovení čistoty a monitorování agregátů biopharmak, jako je inzulin. Vzhledem k rostoucímu významu biosimilárních i inovátorových inzulinů v léčbě diabetu je klíčové zajistit spolehlivou a reprodukovatelnou metodu pro rutinní kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit SEC metodu podle návrhu evropské farmakopeje pro rozlišení inovátorového a biosimilárního inzulinu. Metoda využívá Agilent AdvanceBio SEC 130 Å 7,8 × 300 mm 2,7 µm kolonu a zahrnuje testy system suitability, preciznosti, lineárního rozsahu, citlivosti, detekci agregátů a kvantifikaci nečistot.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC System (pumpa G5611A, autosampler G5667A, termostat G1330B, DAD VL G1315D, bio-inert kolona G1316C)
• Kolona Agilent AdvanceBio SEC, 130 Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm

Podmínky chromatografie

• Mobilní fáze: 200 mL anhydr.acetic acid, 300 mL acetonitril, 400 mL voda, pH 3,0 (NH₃); doplněno na 1000 mL vodou
• Průtok: 0,5 mL/min; injekční objem: 10 µL; detekce UV 276 nm; běh isokratický
• Příprava vzorků: inovátorový a biosimilární inzulin skladovaný dle instrukcí výrobce; agregáty připraveny tepelným stresem (6 h při 60 °C)
• Software: Agilent ChemStation B.04.03 nebo vyšší

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala:

• Vynikající rozlišení monomeru inzulinu a m-cresolu (mezi 16,4 a 49,5 min)
• Preciznost retence i plochy monomeru: RSD ≤ 0,06 % (RT) a ≤ 0,66 % (plocha)
• System suitability: symetrie špičky ~1,7; P/V > 2; nečistoty před RT monomeru ≤ 0,3 %
• Citlivost: LOD 11,3 µg/mL, LOQ 28 µg/mL (S/N > 3 a > 10)
• Lineární rozsah: 10,6–3400 µg/mL s R² = 0,9999
• Špičková baseline separace agregátů při 11,18 a 13,88 min
• Reprodukovatelnost mezi výrobními šaržemi: čtyři různá media AdvanceBio SEC ukázala nerozlišitelné chromatogramy standardních proteinů
• Životnost kolony: po 250 injekcích stejná RT, plocha, tvar špičky i počet plat znamenající dlouhodobou stabilitu

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Spolehlivou rutinní kontrolu kvality inzulinových přípravků v institucionálních i průmyslových QC laboratořích
• Možnost sledovat monomerní formu i agregáty a detekovat degradaci při stresových studiích
• Snižování nákladů díky dlouhé životnosti a vysoké reprodukovatelnosti kolony
• Snadnou integraci do existujících bio-inertních LC systémů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry:

• Aplikace obdobných SEC metod na další biotherapeutika (monoklonální protilátky, hormony, enzymy)
• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci nečistot a posttranslačních modifikací
• Automatizace přípravy vzorků a on-line monitoring stability biopharmak
• Miniaturizace kolon a zvyšování průtokových rychlostí pro rychlejší analýzy

Závěr

Vyvinutá SEC-UV metoda na Agilent AdvanceBio SEC kolonu splňuje farmakopejní požadavky na rozlišení, preciznost, citlivost i linearitu pro srovnání inovátorového a biosimilárního inzulinu. Díky bio-inertnímu systému a robustní koloně je vhodná pro každodenní QC i vývojové účely.

Reference

1. Kannan V.; Narayanaswamy P.; Gadamsetty D.; Hazra P.; Khedkar A.; Iyer H. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009, 23(7), 1035–1042.
2. Pharmeuropa, Vol. 23, No. 2, April 2011.