Advantages of Agilent AdvanceBio SEC Columns for Biopharmaceutical Analysis

Význam tématu

Velikostní vylučovací chromatografie (SEC) představuje klíčovou techniku pro určování molárních hmotnostních průměrů a separaci biomolekul podle velikosti. V biotechnologické a farmaceutické praxi je spolehlivá separace proteinů, monoklonálních protilátek (mAb) a komplexních konjugátů (ADC) nezbytná pro kontrolu kvality, charakterizaci produktů a zajištění bezpečnosti léčivých přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technického přehledu bylo porovnat výkon Agilent AdvanceBio SEC kolon s obdobnými SEC sloupci od jiných výrobců. Studie zahrnovala separaci:

• Standardních proteinových markerů (thyreoglobulin, IgG, BSA, myoglobin a uracil jako permeační marker),
• Terapeutických monoklonálních protilátek (rituximab, trastuzumab),
• Antibody drug conjugates (ADC).

Hodnoceny byly faktory rozlišení, kapacita, linearita kalibračních křivek a špičkový tvar pod různými podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Mobilní fáze: 150 mM fosfátový pufr, pH 7,0
• Průtok: 0,8 mL/min (7,8×300 mm), 0,4 mL/min (4,6×300 mm)
• Objem injekce: 5 µL
• Detekce: UV 220 nm
• Teplotní udržovací systém: ambient

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC
• Agilent 1290 Infinity Binary LC s G1315D DAD a bio-inertní flow cell (max. 1200 bar)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání 7,8×300 mm kolony AdvanceBio SEC (300 Å, 2,7 µm) s kolunami A–E prokázalo:

• Nejvyšší faktor rozlišení (Rs až 5,59) pro oddělení lehkých proteinů (myoglobin–uracil).
• Optimální objem pórů (7,11 mL) vedoucí k lepší kapacitě a lineární kalibraci přes široký rozsah (662 kDa–112 Da).
• Výrazně užší špičky, vyšší citlivost a přesnější integraci stop agregátů než u ostatních sloupců.

Pro separaci monoklonálních protilátek (trastuzumab, rituximab) AdvanceBio SEC dosáhla Rs nad 2,3, kdežto konkurenční sloupce vykazovaly Rs pod 2,0 a rozostřené agregáty. Při analýze ADC na AdvanceBio SEC v čistě vodném systému byly pozorovány symetrické špičky (Rs = 1,75) bez potřeby organického modifikátoru, na rozdíl od ostatních kol, kde docházelo k nespecifickým interakcím a deformaci píků.
Porovnání 4,6×300 mm kolony AdvanceBio SEC (300 Å, 2,7 µm) se sloupci F a G potvrdilo:

• Vyšší objem pórů (2,36 mL) a lepší linearitu kalibrace (R² = 0,97).
• Rozlišení proteinových markerů Rs až 3,61 a detekci degradovaných forem mAb.
• Optimalizovanou citlivost a nižší provozní tlak (~176 bar) oproti sub-2 µm kolónám (~380 bar).

Přínosy a praktické využití metody

AdvanceBio SEC nabízí:

• Vysokou reprodukovatelnost a rozlišení pro kvantifikaci monomerů, agregátů a fragmentů.
• Možnost čistě vodného provozu u ADC bez organických modifikátorů a zkrácení doby analýzy.
• Robustnost systému díky kontrolovanému pórům a hydrofilnímu povlaku proti nonspecifické adsorpci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry:

• Nasazení řazení dvou sloupců AdvanceBio SEC v sérii pro vyšší kapacitu a rozlišení.
• Integrace s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) pro detailní charakterizaci proteomických vzorků.
• Vývoj mikro- a kapilárních formátů pro vysokoprůtokovou analýzu a aplikace v klinické diagnostice.

Závěr

Agilent AdvanceBio SEC kolony prokázaly nadřazený výkon oproti konkurenčním sloupcům při separaci proteinových standardů, monoklonálních protilátek a ADC. Jejich optimalizovaný pórů, vysoká kapacita a odolnost vůči poškození umožňují spolehlivé a citlivé analýzy v biopharmaceutické kontrole kvality.

Reference

• Agilent Technologies. AdvanceBio SEC Columns Technical Overview. 2018.