Comparison of Biosimilar and Innovator Monoclonal Antibody Rituximab Using the Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC System and Agilent OpenLAB Match Compare Software

Význam tématu

Bioterapeutika, zejména monoklonální protilátky jako rituximab, hrají klíčovou roli v léčbě autoimunitních a onkologických onemocnění. Vývoj biosimilárních produktů po vypršení patentů originálních léčiv vyžaduje důkladnou analýzu fyzikálně-chemické a biologické podobnosti, aby byla zajištěna bezpečnost a účinnost pro pacienty.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat biosimilární a originální rituximab pomocí zpětně fázové HPLC (RP HPLC), chromatografie gelové filtrace (SEC) a peptide mappingu s UV detekcí a ověřit biologickou aktivitu v komplement-závislé cytotoxicitě (CDC). Klíčovým prvkem byla aplikace Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC systému a OpenLAB CDS Match Compare softwaru pro objektivní srovnání chromatogramů.

Použitá instrumentace

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC Pump (G5611A)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert High Performance Autosampler (G5667A)
• Agilent 1200 Infinity Series Thermostat (G1330B) a Bio-inert Column Compartment (G1316C option 19)
• Agilent 1260 Infinity DAD VL s bio-inert flow cell (G1315D option 28)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Analytical-scale Fraction Collector (G5664A)
• OpenLAB CDS ChemStation Edition (Rev. C.01.02)
• OpenLAB CDS Match Compare (A.01.01)

Metodika

Vzorky pro intact a redukované mAb byly připraveny ředěním, redukcí DTT a alkylací iodoacetamidem. Pro peptide mapping byla použita tryptická štěpná reakce. Chromatografické analýzy probíhaly za následujících podmínek:

• RP HPLC intact mAb: Poroshell 120 SB-C18, 5–95 % organiky za 15 min, detekce při 214 a 280 nm.
• RP HPLC redukovaného mAb: shodný sloupec, eluce fragmentů LC/HC pod 8 min.
• SEC nonredukované i redukované mAb: Bio SEC-3 300 Å, izokratický režim, rozlišení monomerů, agregátů a řetězců.
• Peptide mapping: AdvanceBio Peptide mapping, gradient 2–90 % organiky v 61 min.
• CDC bioasay: WIL2S buněčná linie, vyhodnocení GrafPad Prism.

Hlavní výsledky a diskuse

• RP HPLC intact mAb: téměř identické chromatogramy; automatické párování špiček softwarem Match Compare potvrdilo 100 % podobnost.
• RP HPLC redukované mAb: fragmenty LC/HC separovány rychle s odchylkami časů, ale shodnými plochami.
• SEC intact i redukované mAb: monomerová čistota > 99 %, chromatogramy biosimiláru a originálu stejné.
• Peptide mapping: všechny klíčové peptidové špičky byly 1:1 přiřazeny; primární struktura konzistentní.
• CDC bioasay: relativní biologická aktivita biosimiláru byla 111 % oproti originálu, v rámci akceptovatelných limitů.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované LC-UV metody s objektivním softwarovým párováním automatizují a zrychlují proces komparability, minimalizují subjektivní chyby a poskytují reprodukovatelné výsledky pro QC a validaci biosimilárních produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na LC-MS/MS pro hloubkovou charakterizaci posttranslačních modifikací.
• Implementace umělé inteligence a strojového učení pro predikci změn kvality.
• Vyšší propustnost a online monitoring výrobních procesů.
• Integrace digitálních databází chromatografických fingerprintů pro rychlé porovnání nových šarží.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC systému a OpenLAB Match Compare softwaru spolehlivě rozlišuje a potvrzuje vysokou podobnost biosimilárního a originálního rituximabu jak fyzikálně-chemicky, tak biologicky, což usnadní vývoj a registraci biosimilárních monoklonálních protilátek.

Reference

1. P. Visser et al. Physicochemical and Functional Comparability Between the Proposed Biosimilar Rituximab GP2013 and Originator Rituximab. BioDrugs 2013, 27, 495–507.
2. Diteba. Protein Characterization, online resource.
3. Agilent Technologies Application Note 5991-1694EN: QA/QC of Monoclonal Antibodies: High-resolution peptide mapping analysis.
4. Agilent Technologies Data Sheet 5991-2553EN: OpenLAB CDS Match Compare for Chromatographic Peak Matching and Comparison.