Fast and High Resolution Analysis of Intact and Reduced Therapeutic Monoclonal Antibodies (mAbs)

Význam tématu

Analýza terapeutických monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová pro vývoj a kontrolu kvality biopharmaceutik. Tyto protilátky představují nejrychleji rostoucí třídu léčiv a biosimilary vstupují do klinických studií vysokým tempem. Pro podporu vývoje a zajištění kvality je proto nutná analytická metoda umožňující rychlou a vysoce rozlišenou separaci intactních a redukovaných forem mAb.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout rychlou a vysoce výkonnou metodu reverzní fáze HPLC pro intactní a redukované formy inovátorských a biosimilárních mAb, demonstrovanou na modelu rituximabu. Separace byla provedena za použití bio-inertního systému Agilent 1260 Infinity v kombinaci se sloupci AdvanceBio RP-mAb C4 a Diphenyl.

Použitá metodika a instrumentace

Pro chromatografii byly zvoleny superficially porous částice o velikosti 3,5 µm s póry 450 Å. Mobilní fáze: A – voda s 0,1 % TFA, B – směs izopropanolu:acetonitrilu:vody (70:20:10) s 0,09 % TFA. Gradient z 15 % na 60 % fáze B během 4 minut, průtok 1,0 mL/min, teplota kolony 80 °C, objem injekce 1 µL, detekce při 220 a 280 nm.
Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC (600 bar)
• Agilent 1260 Infinity Bio-inert High Performance Autosampler
• Agilent 1200 Infinity Thermostatted Column Compartment s bio-inertními topnými články
• Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector s 60 mm Max-Light flow cell

Vzorky: rituximab 2 mg/mL v PBS; redukce s 10 mM TCEP při 60 °C po 30 minutách.

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní mAb se na sloupci C4 eluovaly za 1,96 min a na Diphenylu za 2,51 min s výbornou rozlišitelností. Po redukci se lehký a těžký řetězec oddělily do 4 min. RSD retenčního času byl < 1,5 % a RSD plochy < 5 %. Zrcadlové chromatogramy innovátoru a biosimiláře potvrzují vysokou chromatografickou podobnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a robustní postup pro QA/QC intactních i redukovaných mAb
• Bio-inertní systém eliminuje interakce s kovovými povrchy
• Krátké doby analýzy zvyšují propustnost laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další bioterapeutika, integrace s hmotnostní spektrometrií a UPLC, a vývoj plně automatizovaných vysokopropustných platforem pro vývoj biosimilárů a kontrolu kvality.

Závěr

Navržená RP-HPLC metoda s bio-inertním LC systémem a AdvanceBio RP-mAb sloupci poskytuje rychlou, vysoce rozlišenou a reprodukovatelnou analýzu intactních i redukovaných forem mAb, vhodnou pro komparabilní studie v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

• Navas N et al. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 9351–9363