Identification of Host Cell Proteins (HPCs) in Monoclonal Antibodies At Sub-ppm Levels Using the SYNAPT XS Mass Spectrometer

Význam tématu

Monitorování zbytkových proteinů hostitelské buňky (HCP) v monoklonálních protilátkách je klíčové pro zajištění bezpečnosti, účinnosti a stability bioterapeutik. I při vysoké čistotě protilátek mohou zůstat nízkokoncentrované HCP, které mohou vyvolat imunitní odpověď nebo způsobit degradaci léčiva.

Cíle a přehled studie

Tato studie představuje vysoce citlivou metodu pro objevování HCP na sub-ppm úrovni pomocí HDMSE datově nezávislé akvizice na hmotnostním spektrometru SYNAPT XS. Cílem bylo identifikovat a kvantifikovat co nejnižší množství HCP v referenčním NIST mAb vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci peptidů byla použita kolona ACQUITY PREMIER CSH C18 (1,7 µm, 2,1×150 mm) při 60 °C a průtoku 50 µL/min. Mobilní fáze sestávala z 0,1 procenta kyseliny formiové ve vodě (A) a v acetonitrilu (B).

Pro vzorkovou přípravu byl adaptován protokol založený na precipitaci protilátky při natívním tryptickém štěpení. Díky rezistenci mAb vůči trypsinu zůstává většina protilátky nedotčena, zatímco volné HCP se efektivně rozštěpí a poté oddělí centrifugací.

Instrumentace:

• Hmotnostní spektrometr SYNAPT XS QTof v ESI+ režimu
• HDMSE režim akvizice s rozsahy m/z 50–2000 a skenovací dobou 1,0 s
• Optimalizace kolizní energie v závislosti na driftových časech iontů
• Software MassLynx 4.2 a Progenesis QI for Proteomics v4.2

Hlavní výsledky a diskuse

HDMSE akvizice umožnila identifikovat 48 různých HCP napříč koncentracemi od sub-ppm po jednotky ppm, s detekčním limitem 100 ppb. Ve srovnání s konvenčním MSE režimem, který detekoval pouze 5 nejhojnějších HCP (limit kolem 10 ppm), přináší HDMSE až stonásobné zlepšení citlivosti.

Srovnání se dvěma dřívějšími studiemi ukázalo, že 14 HCP bylo společných všem třem datasetům, zatímco HDMSE přineslo 20 unikátních proteinů, z nichž 14 bylo zachyceno pod 1 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost detailní charakterizace HCP profilu pro zajištění kvality bioprocesu
• Zvýšená citlivost umožňuje včasnou detekci nežádoucích proteinových kontaminant
• Široké proteomické pokrytí individualizovaných HCP

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace dalších obohacovacích kroků a fractionačních technik pro hlubší analýzu
• Propojení s umělou inteligencí pro automatickou identifikaci a kvantifikaci HCP
• Vývoj specializovaných iontových mobilních zařízení pro rychlejší separaci koelujícící se peptidů
• Regulační harmonizace a standardizace MS-based HCP metod na mezinárodní úrovni

Závěr

Použití HDMSE akvizice na hmotnostním spektrometru SYNAPT XS výrazně zlepšuje schopnost identifikovat a kvantifikovat nízkokoncentrované HCP v monoklonálních protilátkách. Detekční limit 100 ppb představuje významný posun oproti tradičním přístupům a přispívá k vyšší kvalitě a bezpečnosti bioterapeutik.

Reference

1. Hogwood BD Smales MC Measurement and Control of Host Cell Proteins HCPs in CHO Cell Bioprocesses Curr Opin Biotechnol 2014 30 153 160
2. Doneanu CE Anderson M Williams BJ Lauber MA Chakraborty A Chen W Enhanced Detection of Low-Abundance Host-Cell Protein Impurities in High-Purity Monoclonal Antibodies Down to 1 ppm Using Ion Mobility Mass Spectrometry Coupled with Multidimensional Liquid Chromatography Anal Chem 2015 87 10283 10291
3. Weibin C Doneanu CE Lauber MA Koza S Prakash K Stapels M Fountain KJ Improved Identification and Quantification of Host Cell Proteins HCPs in Biotherapeutics Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry ACS Symp Ser 2015 3 357 393
4. Huang L Wang N Mitchell CE Brownlee T Maple SR De Felippis MR A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies Anal Chem 2017 89 5436 5444
5. Chen IH Xiao H Daly T Ning L Improved Host Cell Protein Analysis in Monoclonal Antibody Products through Molecular Weight Cutoff Enrichment Anal Chem 2020 92 3751 3757
6. Wang Q Slaney TR Wu W Ludwig R Tao L Leone A Enhancing Host-Cell Protein Detection in Protein Therapeutics Using HILIC Enrichment and Proteomic Anal Chem 2020 92 10327 10335