Automated RapiFluor-MS Labeled Glycan Sample Preparation for Disulfide-Rich Glycoprotein

Význam tématu

N-glykany jsou klíčovým atributem bioterapeutik, protože ovlivňují skládání, konformaci, stabilitu a klinickou účinnost terapeutických proteinů. Analýza N-glykanů je technicky náročná vzhledem k jejich strukturální heterogenitě a citlivosti na podmínky výroby. U disulfidově bohatých glykoproteinů, jako je lidský choriový gonadotropin (hCG), mohou disulfidové můstky omezovat přístup enzymu PNGase F a vyžadují redukční kroky pro úplné uvolnění glykanů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto příspěvku je představit zautomatizovaný protokol pro redukci, uvolnění, značení a purifikaci N-glykanů z disulfidově bohatých glykoproteinů pomocí RapiFluor-MS reagencie na platformě Andrew+ Pipetting Robot. Metoda byla ověřena na standardní monoklonální protilátce (mAb) a na komplexním hCG, s důrazem na rychlost, reprodukovatelnost a vhodnost pro rutinní QC i výzkum.

Použitá metodika

Protokol zahrnuje následující kroky:

• Redukce disulfidových můstků a denaturace bílkoviny pomocí DTT a surfaktantu RapiGest při 90 °C.
• Deglykozylace enzymem PNGase F při 50 °C.
• Značení uvolněných glykanů RapiFluor-MS činidlem a quenching 0,5 M roztokem amonium acetátu (volitelné pro HILIC separaci).
• Purifikace glykanů na HILIC µElution desce, oplach 1 % formicou v 90 % acetonitrilu a eluční kroky pro odstranění přebytečného štíticího činidla.

Použitá instrumentace

• Andrew+ Pipetting Robot umístěný v chemické digestoři s konfigurací 2–3 řad domino modulů.
• ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System
• FLR detektor (excitace 265 nm, emise 425 nm)
• ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column, 1.7 µm, 2.1×150 mm, 130 Å
• Mobilní fáze A: 50 mM amonium formiát, pH 4.4; B: acetonitril
• Empower 3 software pro řízení a vyhodnocení dat

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro mAb byly chromatografické profily redukčního i neredukčního protokolu komparabilní s RSD ≤ 5 % pro hlavní glykoformy.
• Automatizovaná příprava až 32 vzorků za hodinu dosahovala srovnatelné výtěžnosti a reprodukovatelnosti vůči manuální přípravě.
• U hCG umožnila redukce DTT uvolnění glykanů, které při neredukčním postupu nebyly plně přístupné, což se projevilo zvýšením intenzit vybraných píků.
• Relativní podíly devíti klíčových glykanových složek hCG vykázaly RSD ≤ 7 % napříč manuálními i automatizovanými běhy.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá automatizace až 32 vzorků za 1–1,1 hodiny.
• Vysoká reprodukovatelnost a konzistence vhodná pro QC i výzkum.
• Kompatibilita s komerčními i akademickými laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další disulfidově bohaté a strukturálně komplexní glykoproteiny, včetně bioterapeutik a biomarkerů. Další miniaturizace, integrace s online hyphenovanými systémy a vývoj nových štíticích reagencií a chromatografických fází slibují zvýšení citlivosti, throughput a snížení nákladů.

Závěr

Automatizovaný RapiFluor-MS redukční protokol na platformě Andrew+ nabízí rychlý, reprodukovatelný a QC-přátelský postup pro uvolnění a analýzu N-glykanů z disulfidově bohatých glykoproteinů, jak bylo prokázáno na mAb i hCG. Výnosy a relativní obsahy glykanů jsou srovnatelné s manuálními metodami, což potvrzuje vhodnost metody pro rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

1. Varki A. a kol. Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2017.
2. Zhang P. et al. Drug Discovery Today, 2016, 21(5), 740–765.
3. Hires M. et al. Diagnostics, 2019, 9(4), 156.
4. Biskup K. et al. Glycoconjugate Journal, 2020, 37(5), 599–610.
5. Lauber M. A. et al. Analytical Chemistry, 2015, 87(10), 5401–5409.
6. Koza S. M. et al. Waters Application Note 720005506EN, 2020.
7. Reed C. E. et al. Waters Application Brief 720007008EN, 2020.
8. Waters Brochure 720006992EN, 2021.
9. Waters Brochure 720006991EN, 2020.
10. Lauber M. A. et al. Waters Application Note 720005275EN, 2015.