MONITORING NUTRIENT STATUS IN CELL CULTURE MEDIA USING UPLC TECHNOLOGY

Význam tématu

V biotechnologické výrobě je přesné sledování stavu živin v buněčných kulturách klíčové pro optimalizaci růstových podmínek, zvýšení výnosu cílové bílkoviny a zachování její kvality během fermentačního procesu.

Cíle a přehled studie

Metoda kombinuje analýzu aminokyselin pomocí pre-kolumní derivatizace AccQ·Tag a přímou analýzu vodou rozpustných vitamínů v buněčných médiích.
Cílem bylo vyvinout rychlou, citlivou a spolehlivou UPLC proceduru pro kontinuální monitorování klíčových živin (aminokyselin a B vitamínů) během vývoje biopharmaceutických procesů.

Použitá metodika a instrumentace

• Pre-kolumní derivatizace aminokyselin AccQ·Tag Ultra.
• Separační systém Waters ACQUITY UPLC s PDA detektorem.
• Kolony ACQUITY UPLC HSS T3 1,8 µm 2,1×50 mm, BEH C18 a HSS C18.
• Mobilní fáze s iontovým párováním (0,035–0,05 % HFBA, alternativně TFA).
• Detekční vlnové délky 270 nm (většina B vitamínů) a 214 nm (B5, B7).
• Teplota kolony pro aminokyseliny 60 °C, vzorky 10× zředěné.

Hlavní výsledky a diskuse

• Úspěšné oddělení a kvantifikace 20 aminokyselin a několika B vitamínů v one-shot analýze bez složité předúpravy.
• Optimální retence a tvar piků vitamínů dosaženo na HSS T3 sloupci a 0,038 % HFBA.
• Lineární rozsah metody pro vitamíny: 2,5–100 ng na kolonu při 270 nm; 20–100 ng při 214 nm.
• Detekční limity cca 0,5 ng na kolonu, v nejlepších případech až 0,1 ng (v závislosti na vitamínu).
• Reprodukovatelnost area %RSD < 6 % pro vitamíny přítomné v médiu (pět opakovaných injekcí).
• Změny koncentrace aminokyselin sledovány v čase (dny 1, 3, 6), ukazují dynamiku spotřeby a produkce.

Přínosy a praktické využití metody

Rychlý monitoring živin umožňuje:

• Průběžnou optimalizaci krmného režimu buněčných kultur.
• Okamžitou detekci nedostatku kritických složek a prevenci výnosových propadů.
• Standardizaci QA/QC procesů v biotechnologickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace online UPLC kontrol pro automatizovanou regulaci živin.
• Rozšíření na multiplexní analýzu vitamínů, stopových prvků a metabolitů.
• Využití strojového učení k predikci optimálních podmínek na základě dat z UPLC.

Závěr

Navržené UPLC řešení pro simultánní sledování aminokyselin a vodou rozpustných vitamínů nabízí vysokou rychlost, citlivost a reprodukovatelnost. Metoda přispívá k lepší kontrole a optimalizaci bioprocesů, což podporuje vyšší výtěžky a opakovatelnost v produkci biopharmaceutik.

Použitá instrumentace

• Waters ACQUITY UPLC System s PDA detektorem.
• ACQUITY UPLC HSS T3, BEH C18, HSS C18 kolony.
• AccQ·Tag Ultra derivatizační činidlo, HFBA a TFA iontové párovací činidla.
• Vitaminové standardy (Sigma-Aldrich, Acros Organics) a mediální komponenty (Mediatech).

Reference

• Jablonski JM, Wheat TE, Hong P, Diehl DM. Monitoring nutrient status in cell culture media using UPLC technology. Waters Corporation, 2008.