Charge Profiling of 2AB-labelled N-linked Glycans

Význam tématu

Glykanová modifikace terapeutických proteinů výrazně ovlivňuje jejich farmakologické vlastnosti. Profilování náboje N-glykanů umožňuje stanovit počet přítomných sialových kyselin, což je zásadní pro kontrolu kvality, bezpečnosti a účinnosti bioterapeutických přípravků.

Cíle a přehled studie / článku

Účelem studie bylo demonstrovat schopnost Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC se fluorometrickou detekcí rozlišit a přesně kvantifikovat N-glykany s různým počtem sialylací od neutralních až po penta-sialylované formy extrahované z bovinního fetuinu.

Použitá metodika a instrumentace

• Enzymatické uvolnění N-glykanů z bovinního fetuinu pomocí PNGase F
• Označení glykanů 2-aminobenzamidem (2-AB) a následné čištění pomocí HILIC cartridgí
• Aniontově výměnná chromatografie na Agilent Bio SAX kolóně (2.1 × 250 mm, 5 µm) s bio-inert hardwarem
• Fluorescenční detekce (Ex 260 nm, Em 430 nm)
• Gradient mobilních fází z 0 až 100 % 250 mM amonného formiátu (pH 4,5) v acetonitrilu/vodě
• Injekční objem 0,5 µL, průtok 0,2 mL/min, teplota autosampleru 5 °C, kolóna při ambientní teplotě

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila vysoce rozlišené chromatografické oddělení glykanů obsahujících 0 až 5 sialových kyselin. Relativní standardní odchylka retenční doby byla nižší než 0,002 % a pro plochu píků pod 10 %, což potvrzuje vynikající opakovatelnost a přesnost při rozlišování i blízkořízených glykoform.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kontrola glykačního profilu bioterapeutik v rámci QA/QC procesů
• Monitorování úrovně sialylace pro zajištění konzistence výrobních šarží
• Rychlá a reprodukovatelná analýza bez nutnosti přímé hmotnostní spektrometrie

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na analýzu dalších glykoproteinů a komplexnějších glykanových struktur. Integrace s hmotnostní spektrometrií pro hlubší strukturální charakterizaci a automatizace přípravy vzorků zvýší propustnost a efektivitu glykanových analýz.

Závěr

Aniontově výměnná chromatografie s fluorescenční detekcí na systému Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC poskytuje rychlé, precizní a vysoce rozlišené profilování N-glykanů podle počtu sialylací. Metoda je vhodná pro rutinní i výzkumné aplikace v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu.

Reference

1. Gil GC et al. High Throughput Quantification of N-Glycans Using One-Pot Sialic Acid Modification and MALDI-TOF MS. Anal Chem. 2010;82:6613-6620.
2. Schneider S. Sensitive and reproducible glycan analysis of human Immunoglobulin G. Agilent Technologies Application Note 5991-4801EN;2014.
3. Fernandes D. Biopharmaceutical Sialylation. Eur Biopharm Rev. 2006;Spring:100-104.